微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告姓名：王晶晖专业年级：2011级生物技术学号：040312011032实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。二、实验原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。三、实验器材1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），香柏油。3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。四、实验方法（一）简单染色1涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑12环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取12环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。2晾干：让涂片自然晾干。3固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰（通常23次）固定（具体温度以不烫手为宜）。4染色：将固定过的涂片加复红染色12min5水洗：用水洗去涂片上的染色液。6干燥：将吸过地涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。7镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上滴加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌形态。（二）革兰氏染色1.涂片：涂片方法与简单染色法涂片相同。2.晾干：与简单染色法相同。3.固定：与简单染色法相同。4.结晶紫染色：将玻片加适量（盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min。5.水洗：倾去染色液，用自来水小心地冲洗至流出的水无色为止。6.媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。7.水洗：用自来水洗去碘液。8.脱色：将玻片倾斜，连续点滴95%乙醇通过涂面脱色2025s至流出液无色，立即水洗。9.复染：滴加番红复染13min。10.水洗：用自来水洗去涂片上的番红染色液。11.晾干：将染好的涂片方空气中晾干或者用吸水纸吸干。12.镜检：镜检时先用低倍物镜，再用高倍物镜，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。13.实验完毕的处理：将浸过油的镜头按下述步骤擦拭干净。先用擦镜纸将油镜上的油擦去。再用擦镜纸沾少许显微镜镜头擦拭液将镜头擦23次。最后用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意：擦镜头时向一个方向擦拭。五、实验报告 绘出金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。六、实验分析第一次做微生物的实验，总体来说还可以，但对革兰氏染色的方法还是不是很熟悉，实验结果感觉一般，效果不是十分明显，应该是制片做的不是很成功，还有第一次接触油镜，用起来不是很顺手，望以后能实验顺利。七、思考题1、对未知菌进行革兰氏染色时，怎样确保你的染色正确、结果可靠？答：找事先已知的且和未知菌形态明显不同的G+和G-分别做混合涂片，当和G+做时G+正确显紫色和当和G-做时G-正确显红色，看这个未知菌分别显什么色，若一致，则可确定此菌为G+或G-。再回过头单做此未知菌的革兰氏染色，显现正确那就证明此染色技术操作正确。也可在开始做已知的与此菌形态明显不同的G+和G-三者混合涂片，一下知晓此未知菌的阴阳性，再回过头来染色。2、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？答：1、如果过于浓厚，菌体会很难吸附到载玻片上，染色冲洗过程中很容易被冲下来 2、表层被染色，但是内层菌体很难染色。 3、显微镜观察时很难看清，细胞重叠。3、革兰氏染色时，处染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？答：(1)不能，初染之前加的话，就会先和染料结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞壁进入细菌的质膜，达不到初染的效果。(2)革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌无色。4、你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？答：当菌体为革兰氏阳性菌时，可以省去复染这个步骤。5、用油镜观察时为什么要完全晾干？答：因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净.另外,一般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.6、革兰氏染色成败的关键是什么？答：染色时，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。7、叙述无菌操作时应注意的问题？答：1、使用前超净工作台开15分钟紫外线 2、注意开通风3、使用的器皿注意消毒4、操作时戴无菌手套或并用75%酒精消毒5、操作时尽量靠近酒精灯火焰