4-显微镜及荧光显微镜原理

1,一 光学显微镜 的历史,17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。 1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。,16731677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出成就。,Abbe & Zeiss,Ernst Abbe together with Carl Zeiss published a paper in 1877 defining the physical laws that determined resolving distance of an objective. Known as Abbes Law,Abbe,Abbe & Zeiss,Abbe and Zeiss developed oil immersion systems by making oils that matched the refractive index of glass. Thus they were able to make the a Numeric Aperture (N.A.) to the maximum of 1.4 allowing light microscopes to resolve two points distanced only 0.2 microns apart (the theoretical maximum resolution of visible light microscopes).,Zeiss student microscope 1880,19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。,二、 显微镜的基本光学原理,Light Pathway of Microscope,三 光学显微镜的重要技术参数,在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。 显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。,1数值孔径,数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。 数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（ ）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=n sin /2,孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。,Numerical Aperture,http:/micro.magnet.fsu.edu/,The wider the angle the lens is capable of receiving light at, the greater its resolving power The higher the NA, the shorter the working distance,显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。,表一、几种介质的折射率,介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好。 sin /2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5。,2分辨率,显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称“鉴别率“。其计算公式是 R=0.61/NA R为最小分辨距离； 为光线的波长； NA为物镜的数值孔径。 可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则值越小，分辨率就越高。,http:/www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasresolution.html,Resolution depends on the Numerical Aperture,Resolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes.,要提高分辨率，即减小R值，可采取以下措施 （1）降低波长值，使用短波长光源。 （2）增大介质n值以提高NA值 （NA=n sin a/2）。 （3）增大孔径角a值以提高NA值。 （4）增加明暗反差。,3放大率和有效放大率,由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目镜放大率1的乘积： =1 显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。 放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。,分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式：500NA1000NA 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。,普通光线的波长为400700nm，光镜分辨力约为0.2m，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。,4焦深,焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系： （1）焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。 （2）焦深大，分辨率降低。 由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。,5视场直径（FieldOfView）,观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。,6覆盖差,显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。 国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。,7工作距离WD,工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。 数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。,四 光学显微镜的种类,亮视野显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 体视显微镜 荧光显微镜,正置显微镜 倒置显微镜、,（一）Upright and Inverted Microscope,Image from Nikon promotional materials,荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、 蓝紫光、蓝光及绿光等去激发样品，只要样 品中含有可产生荧光的成分，它便吸收短波 的激发光而释放出波长较长的荧光。,（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope,Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green,用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,特点： 光源为短波光，诱导产生荧光与背景的反差很大。 特定的物质（荧光探针）发出特定的荧光，易于鉴别。能进行多重染色. 所需荧光探针浓度低，减轻对细胞的伤害，有利于活体观察。,用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析,透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。,荧光显微镜种类,汞灯,透射荧光显微镜原理,目镜,吸收滤色镜,物镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯,透射式荧光显微镜优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱所以对观察较大的标本材料较好。,白灯,汞灯,汞灯,落射式荧光显微镜 激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。,荧光显微镜的主要部件,透射式 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜,落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜,落射光激发的荧光法 （incident-light fluorescence Epi-FL） 简称为落射荧光法 它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。,落射式荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。 50W的荧光强度比透射荧光法的250W还强。,落射式荧光显微镜原理,落射荧光显微镜各部件特性和作用,超高压汞灯光源: 提供激发光(U、B、G),nm,T%,光源： 超高压汞灯 寿命只有200300小时 灯内气压达到5070个大气压,滤片系统,包括激发滤片，吸收滤片，隔热滤片和分光镜。,激发滤色镜: 波长选择,吸收滤色镜: 透过荧光,阻挡杂光,分色镜: 反射激发光,透过荧光,A 透过,A,A 反射,B,B 透过,B 阻挡,nm,nm,T%,T%,落射荧光显微镜原理,汞 灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物 镜,标 本,荧光显微镜的配套滤片,激发滤色镜带宽对图象的影响,SWB: BP420-480,WB: BP450-480,WIB: BP460-490,NB: BP470-490,FITC+PI,荧光显微镜使用方法 1打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。 2用低倍镜白光观察，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 3选择合适的激发光和滤光片。 4观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊镜头油；,物镜光阑的运用,光栏全开启,光栏适当关小,物镜光阑,适当调节物镜光栏以获得最佳效果,汞灯使用注意事项 汞灯接通电源后需要10-15min预热时间，汞才能充分汽化并形成汞弧，产生高亮度而稳定的激发光。 b. 汞灯在使用过程中，不要随意开关