实验室检测常用技术课件

张雅为 辽宁省疫控中心 2010年11月,实验室检测常用技术,国家动物疫情测报体系管理规范,猪：口蹄疫、猪水泡病、猪瘟、伪狂犬病、猪呼吸与繁殖障碍综合征 牛：口蹄疫、结核、布氏杆菌病、疯牛病 羊：口蹄疫、布氏杆菌病、山羊/绵羊痘、痒病 马属动物：马传贫、马鼻疽 鸡：新城疫、禽流感 鸭、鹅：禽流感,内容,血清学检测： 血凝抑制试验 凝集试验 补体结合试验 皮内变态反应 联免疫吸附试验 病原学检测： 聚合酶链式反应,基本概念,抗原：抗原是指那些能够诱导机体的免疫系统发生免疫应答，产生抗体和致敏效应淋巴细胞，并在体内外与之特异性结合，发生免疫反应的物质。 抗体：是能与相应的抗原特异性结合的蛋白质分子，和机体其他生物大分子一样是细胞的产物，分泌到体液中或表现在细胞表面上。 抗原、抗体反应：抗原和抗体在体外的反应亦称血清学反应。,血凝及血凝抑制试验,试验原理,某些病毒或病毒的血凝素，能选择性的使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（hemagglutination，HA），也称直接血凝反应。 当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（hemagglutination ingibition，HI）反应，也称血凝抑制反应。,试验原理（续）,血凝抑制试验可以用于：应用标准病毒悬液测定血清中的相应抗体；应用特异性抗体鉴定新分离的病毒。 测定动物血清中的血凝抑制抗体，必须首先：滴定病毒或其血凝素对相应红细胞的血凝效价；应用某种或某几种方法处理被检血清，除去其中的非特异性血凝抑制物质。,实验准备,血凝板 0.5%-1%的红细胞悬液 100ul微量移液器 PBS或生理盐水 待检病毒液或检测抗原 待检血清及阳性血清,血凝实验步骤,注：第12孔为阴性对照。 振荡混匀，于室温（20-25 ）放置40分钟后判定结果（如果环境温度太高，可置4环境下）。对照孔红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。,抗原（ul）,结果判定,将板倾斜，观察红细胞有无成泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。,四单位抗原配置,根据血凝试验结果配置4HAU抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU抗原的稀释倍数。如血凝终点滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256/4）。,四单位抗原配置,四单位抗原回滴,4单位抗原(µl),血凝抑制试验步骤,注：第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。 轻轻混匀，静置约40分钟。,结果判定,以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。 只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，实验结果才有效。 HI价小于等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2为可疑，需重复试验；HI价大于等于5log2为阳性。（GB/T 18936-2003）,凝集实验,概述,细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在胶乳、白陶土、离子交换树脂和红细胞的抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（agglutination）。 凝集试验可用于检测抗原或抗体，最突出的优点是操作简便。 凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为直接凝集试验（简称凝集试验）和间接凝集试验。,直接凝集试验,颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现凝集现象的试验称作直接凝集试验（direct agglutination test）。 直接凝集试验按操作方法可分为玻片法和试管法。,玻片法,玻片法为定性试验。 此法简便快速，可用已知诊断抗原悬液检测待检血清是否存在相应抗体。,玻片法,试验准备：,抗原、标准阳性血清、阴性血清 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血、无腐败气味 洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格 吸管或分装器，适于滴加0.03mL 牙签或火柴杆，供搅拌用,玻片法,操作方法：,将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03ml 在受检血清旁滴加抗原0.03ml 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合 每次试验应设阴、阳性血清对照,玻片法,判定：,在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。 受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（-）。（GB/T 18646-2002）,试管法,材料准备：,稀释液：0.5%石碳酸生理盐水。检验羊血清时用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，如果血清稀释用含0.5%石碳酸的10%盐溶液，抗原的稀释也用含0.5%石碳酸的10%盐溶液 抗原、阳性血清和阴性血清 凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱,试管法,置3740 温箱24h，取出检查并记录结果。,试管法,每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照。 牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第一管加1.2ml稀释液和0.05ml被检血清。 大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1:50和1:100，猪、山羊、绵羊和狗用1:25和1:50。,试管法,结果判定,参照比浊管，按各试管上层液体清亮度判读 1）+菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮； 2）+菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮； 3）+菌体凝集显著，液体50%清亮； 4）+凝集物有沉淀，液体25%清亮； 5）-凝集物无沉淀，液体均匀浑浊。,试管法,结果判定,牛、马、鹿、骆驼 1:100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1:50血清稀释，出现“+”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。 牛、马、鹿、骆驼 1:50血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗1:25血清稀释，出现“+”以上凝集现象时，受检血清判定为可疑。 （GB/T 18646-2002）,补体结合试验,概念,补体（complement）是存在于正常动物血清中，具有类似酶活性的一组蛋白质，具有潜在的免疫活性，激活后能表现出一系列的免疫学活性，能协同其他免疫物质直接杀伤靶细胞和加强细胞免疫功能。 正常情况下，补体成分以无活性的酶原形式存在，只有在激活物（如抗原抗体复合物）的作用下，补体各成分才依次被活化。,实验原理,CFT是根据任何抗原抗体复合物可激活、固定补体的特性，用一定量的补体与致敏红细胞来检测抗原、抗体间有无特异性结合的一类实验。 先加入反应系统和补体，给其以优先结合补体的机会，如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原、抗体发生反应后可结合补体，再加入指示系统（SRBL与相应溶血素），由于反应中无游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。如待测系统中不存在待检的抗体或（抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示剂时会出现溶血，为补体结合试验阴性。,实验准备,稀释液：0.85%生理盐水 绵羊红细胞悬液：采成年公绵羊血，用稀释液洗涤3-4次，最后一次以2000r/min离心10min，以稀释液配置成2.5%红细胞悬液 抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素 受检血清：用稀释液作1:10稀释，加热灭能 溶血素 补体 抗原,操作过程,结果判定,第一次判定要求不加抗原的，不加或加抗原的阴性血清对照管，抗原对照管呈完全溶血反应。 初判后静置12h作第二次判定，要求溶血素对照管，补体对照管呈完全抑制溶血。 对照正确即可对受检血清进行判定，受检血清加抗原管的判定参照标准比色管记录结果。 判定标准 0 40%溶血判为阳性反应 50% 90%溶血判为可疑反应 100%溶血判为阴性反应（GB/T 18646-2002）,皮内变态反应试验,实验原理,机体受到某种抗原刺激时，导致T淋巴细胞活化、增殖分化成致敏淋巴细胞，使机体致敏，以后如再次接触相同的抗原，致敏淋巴细胞即释放出各种淋巴因子，一方面使机体表现特异性的细胞免疫，另一方面则发生迟发型变态反应。 结核分支杆菌PPD皮内变态反应,实验操作,注射部位及术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛，直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度，做好记录。 注射剂量：不论大小牛只，一律皮内注射0.1ml(含2000IU)。 注射方法：先以75%酒精消毒，然后皮内注射牛型结合分支菌素PPD，注射后局部应出现小疱，如对注射有疑问，应另选15cm以外的部位或对侧重做。 皮内注射后72h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，做好详细记录。 对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96h和120h分别再观察一次。,结果判定,阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm。 疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm，小于4.0mm。 阴性反应：无炎性反应，皮厚差在2.0mm以下。 凡判定为疑似反应的牛只，于第一次检疫60d后进行复检，其结果仍为疑似反应时，经60d再复检，如仍为疑似反应，应判为阳性。（GB/T 18645-2002）,酶联免疫吸附试验（ELISA）,概述,酶具有高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十、几百个底物分子发生反应，产生放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。 本法自上世纪70年代初期由Van weemen、Schuars及Perlmarn等相继分别报道后，现已引起广泛重视。,原理,将已知抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体或酶标抗原按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。 ELISA可用于检测抗体，也可用于检测抗原。 实验的方法类型有多种，如双抗体夹心法、间接法、竞争法和捕获法等，虽然原理不尽相同，但实验特点和影响因素基本一样。,1.将抗原包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗抗体，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。,4.酶催化底物并显色。,间接法（抗-HCV等）示意图,双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图,1.将抗体包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。,4.酶催化底物并显色。,捕获法（抗-HAV IgM、抗-HDV IgM等）示意图,1.将抗抗体包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗体，则结合 为抗抗体-抗体复合物。,3. 加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标记抗体复合物。,4.酶催化底物并显色。,应用,疾病临床诊断、疾病监测、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。 检查抗原方面：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素等；在血液学方面可用于检查凝固因子、红细胞抗原及结合球蛋白等；在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白、癌胚抗原。 检查抗体方面：用间接法检查抗体，已成功研制出多种传染病和寄生虫病试剂盒，广泛应用于免疫抗体和感染抗体的检测。,PCR实验,概述,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），是指通过合成一段寡核苷酸引物，在存在4种脱氧单核苷酸（dNTP）和Mg2+ 的情况下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的一种体外扩增技术。,PCR的早期设想,核酸的研究已经有100年的历史，20世纪60年代末、70年代初人们致力于基因的体外分离技术。 Korana于1971年最早提出核酸的体外的扩增的设想：DNA经过变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断的重复该过程便可合成tRNA基因。,PCR的实现,1985年美国的