dna重组技术的基本工具71197

基因工程,专题1,烟草,据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人 中国卫生部通报：2004年月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%,能产生狂犬病抗体蛋白的转基因,每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查： 2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状 在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是 的！,通用,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,基因工程的产物,什么叫基因工程？,基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,基因工程的概念,基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的新生物类型和产品,剪切, 拼接, 导入, 表达,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,克里克等提出中心法则,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现 2)工具酶的发现 3)DNA合成和测序技术的发明 4) DNA体外重组的实现 5)重组DNA表达实验的成功 6)第一例转基因动物问世 7)PCR技术的发明,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花 抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生伴胞晶体,转基因棉花有抗虫特性,一、DNA重组技术的基本工具,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,一、DNA重组技术的基本工具,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,一、DNA重组技术的基本工具,一、“分子手术刀” 二、“分子缝合针” 三、“分子运输车”,Go on,转基因,思考：,自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？ 动物容易让外来DNA侵入自身而得以遗传吗？ 为什么？植物呢？ 单细胞生物，容易遭到入侵吗？ 单细胞生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？,可能酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源： 种类与命名： 作用特点： 作用结果：,原核生物,阅读“分子的手术刀”1min,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源： 种类与命名： 作用特点： 4.限制酶识别序列 5.作用结果：,识别特定核苷酸序列,原核生物,产生黏性末端或平末端,Go on,切断磷酸二酯键,具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens）,大肠杆菌 （Escherichia coli R）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,T,磷酸二酯键,A,Go back,限制酶的识别序列：,Go back,Sma,平末端 平末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,重复演示,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,Go back,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,G AATTC CTTAA G,G AATTC CTTAA G,酶切,二、“分子缝合针” DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,E·coli DNA连接酶 或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,类型：,E·coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复 磷酸 二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,Go on,模拟制作：,用剪刀在特定部位对棉花DNA进行模拟切割，并将模拟毒蛋白基因取出，再用胶纸模拟基因种间连接。,棉花的 一段DNA,含毒蛋白基因的细菌DNA片段,Go back,三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件： 有1多个限制酶切点 对受体细胞无害 导入基因能在受体细胞中复制、表达 有某些标记基因，便于筛选 常用运载体： 细菌的质粒 噬菌体或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,Go on,2,7,4,8,3,6,1,5,Go back,思考与探究 P7,1、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示： 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？ 不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究 P7,1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,3、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,对照组：不添加抗生素,实验组1：添加一定浓度的四环素,实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素,实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素,练习,既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因,什么是内含子和外显子？,原核细胞基因的编码区是连续的， 真核细胞基因的编码区是间隔的、不连续的. 真核生物基因的结构特点是：“编码区是间隔的、不连续的。”也就是说：能够编码蛋白质的序列被不能编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫外显子，不能编码蛋白质的序列叫内含子。 真核基因包括编码区和非编码区，编码区又分为外显子和内含子,内含子不翻译蛋白质。,知识拓展,什么是内含子和外显子？,在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。真核生物的结构基因是断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段