细菌遗传与变异 (2)

第三章 细菌的遗传与变异,温州医学院附属二院微生物室 杨锦红,细菌和其他生物一样，具有遗传性和变异性。细菌的形态、结构、新陈代谢、抗原性、毒力以及对药物的敏感性等都是由细菌的遗传物质所决定。 细菌变异包括遗传型变异和非遗传型变异。遗传型变异使细菌产生变种与新种，可稳定遗传给子代。非遗传型变异的发生是受到环境因素的影响，基因结构没有发生改变，不能遗传给子代，,第一节 细菌的遗传物质,染色体 细菌主要的遗传物质 质粒 染色体外的遗传物质 噬菌体 寄生于其他微生物的病毒 转座因子 可位于染色体、质粒或噬菌体上,一、细菌染色体,细菌染色体为一环状双股DNA链，呈超螺旋形式缠绕成团，构成核质，内含细菌主要的遗传信息。 革兰阳性菌核质连接在中介体上 革兰阴性菌核质连接在细胞膜某一点上 目前，已完成约80种细菌全基因序列测定，对深入研究细菌致病机制及进化有重要意义。,二、质粒,质粒为细菌染色体外的遗传物质，环状双股DNA。 质粒携带有遗传信息，控制某些特定的遗传性状，可独立复制，与细菌的遗传变异有关。,1质粒的结构和功能：共价、闭合、环状、超螺旋DNA分子，分子大小为1kb到1000kb左右。质粒编码多种蛋白质，赋于宿主菌多种生物功能，如毒力因子、致育性、耐药性、解降酶、限制酶和修饰酶。现也已分离出不表现任何功能的质粒，称为隐蔽性质粒。,2质粒的特性 不相容性 可转移性 自主复制 细胞内不同质粒的拷贝数不同，取决于质粒复制的控制机制。 大质粒：严密型质粒，严紧型控制，1-3个拷贝 小质粒：松驰型质粒，松驰型控制，40个拷贝 质粒可自然丢失或用人工方法消除。,3质粒的分类 按照质粒编码的生物学性状分类 如耐药性质粒（resistance plasmid，R质粒）、致育因子（fertility plasmid，F质粒）。 2、Novick命名法 用三个英文字母表示，第一个字母一律是小写p（表示质粒），后两个缩写字母用大写，表示发现者、实验室名称、表型性状或其他特征；字母后的编号为阿拉伯数字，区分同一类型的不同质粒。,第二节 突变与诱变,突变（mutation）是遗传型变异中常见的一种类型，是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定的可遗传的改变。 具有某种突变型的个体或细胞称为突变体（mutant）。 细菌自发突变的频率很低（10-6-10-8），诱变剂可增加细菌的突变率。,一、基因型与表型,基因型（genotype）细菌所含有的遗传信息，即DNA中的核苷酸序列。 表型（phenotype ）基因型的具体表现。 野生型（wild-type）某一个菌种最普遍的形态。,基因型：用表示该基因英文单词的头三个小写字母表示，第四个用大写字母表示所涉及的特定基因，如trp表示色氨酸基因，trpA和trpB表示不同的色氨酸基因。 突变基因：在基因符号的右上角加，如组氨酸缺陷型表示为his-；耐药基因在基因符号的右上角加r表示耐药，加s表示敏感，如四环素耐药基因表示为tetr。 表型：以相应基因单词的头三个缩写正体字母表示，第一个字母用大写。或标在右上角，区别野生型或缺陷型，如Phe- 表示没有合成苯丙氨酸的能力，Lac+表示能利用乳糖作为碳源。,二、突 变,（一）突变的类型和机制 自发突变细菌在正常生长条件下和生命活动中所发生的突变。基因组中发生突变的位点称为热点。 点突变与多位点突变,点突变与多位点突变,点突变DNA序列上单个碱基的改变。 多位点突变大范围碱基序列发生了改变，可影响多个基因。包括DNA碱基序列的缺失、插入、倒位、置换、重复、重组或转座。 转换（transition）：一个嘌呤变为另一个嘌呤或一个嘧啶变为另一个嘧啶。 颠换（transversion）：嘌呤变为嘧啶和嘧啶变为嘌呤。,点突变结果,同义突变：碱基的改变不能引起氨基酸的改变，表型无变化。 错义突变：碱基的改变引起氨基酸的改变。 无义突变：碱基序列改变为氨基酸终止密码子（UAA，UAG，UGA），导致氨基酸合成提前终止，形成一个截短的蛋白质。 移码突变：DNA序列上插入或缺失12个核苷酸，引起突变后翻译读码框移位，形成一个完全改变的氨基酸序列。,二、突 变,（二）突变的规律 随机性 稀有性 独立性 稳定性 可逆性,随机性,突变是随机的和不定向的。表现在发生的时间、个体、位点和产生的效应等各方面。可通过以下两个著名的实验证实 彷徨试验（fluctuation test） 影印培养（replica plating）,彷徨试验,影印培养,2稀有性 指正常情况下，突变发生的频率很低。 3独立性 基因突变是独立发生的，一个基因的突变与另一个基因的突变没有相关性，同一细胞中的不同基因其突变率不相同。 4稳定性 基因突变的实质是遗传物质的改变，这种改变是可以稳定遗传的。 5可逆性 突变效应可通过多种方法回复，称基因突变的可逆性。通常由野生型菌株变为突变型菌株的过程为正向突变，反之称为回复突变。,（三）几种常见的突变株,1、温度敏感突变株（TS株）：是一种典型的条件致死突变株。这种突变株在某一温度范围不能生长，但在另一温度下可生长。原因是某些酶的肽链结构发生改变后，降低了酶的抗热性。 2、营养缺陷型突变株：发生了参与合成生长所必需的基本化合物的基因突变。 3、耐药性突变株：对某种药物有一定抵抗力的突变株，临床较常见。 4、发酵阴性突变株：突变后失去发酵某种糖的能力。原因是突变后失去了能分解该糖的酶。,（四）突变株的分离 要从大量的细菌中找到突变株，必须将整个菌群置于一个特殊的生长环境中，该环境可使突变株和其他菌株产生不同的生长表型。如通过影印培养法分离。,三、诱变,人工利用理化因素等诱导产生的突变，可提高细菌的突变率。诱变的变异幅度往往高于自发突变。 能显著提高突变频率的这些理化因素称为诱变剂。诱变剂的诱变效果依赖培养基、PH、温度、基因型等多种因素。,常见的诱变剂,化学诱变剂 碱基类似物 烷化剂 DNA分子嵌入剂 修饰DNA分子的化学药品 物理诱变剂 紫外线 X射线。,第三节 基因水平转移,一、转化,转化（transformation）是细菌从周转环境吸取游离的DNA片段，整合到自身染色体基因组的过程，是基因转移的一种方式。 转化现象在肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜血杆菌等中被证实。,Griffith转化试验,（一）细菌的转化机制,转化要求受体细胞需处于感受态。当外源DNA被受体细胞摄取，并能在其中复制，该受体细胞即称为转化子。,1、感受态,细菌细胞处于可被DNA转化的状态称为感受态。 细菌处于感受态是因为其表面有一种吸附DNA的受体。 感受态出现的时间和持续的时间因微生物物种的不同而有所不同，并与生长条件和周期有关。 一些细菌的感受态可通过诱导产生。如大肠埃希菌在含有一定浓度的CaCl2的环境中可诱发感受态出现。,2、革兰阳性菌的转化机制,典型代表：肺炎链球菌 （1）对数生长期的肺炎链球菌细胞向外分泌感受态因子，诱导细胞出现感受态。 （2）双链DNA吸附在细胞表面特异性受体上。 （3）核酸内切酶将双链DNA随机切割成长约4-5MD的片段，核酸外切酶将双链DNA片段的一条单链分解掉，另一单链与感受态特异性蛋白结合进入细胞。 （4）进入细胞的单链DNA与受体细菌染色体DNA的同源部分配对。 （5）被取代的受体单链DNA被核酸酶分解。,3、革兰阴性菌的转化机制,典型代表：流感嗜杆菌 （1）细菌在感受态细胞形成过程中，形成一种能结合双链DNA的膜结构，称转化小体。 （2）转化小体将双链DNA吸收，外源性DNA以双链形式存在。 （3）当DNA与受体染色体整合，变成单链。,革兰阳性菌和革兰阴性菌转化机制的主要区别 革兰阳性菌 革兰阴性菌 DNA以单链形式进入 DNA以双链形式进入 感受态因子介导、启动 形成转化小体 DNA与蛋白质结合 DNA存在于转化小体 任何来源的同源性DNA 相同物种或亲缘关系相近 物种的同源性DNA,二、人工转化,许多细菌无自然转化的能力，但经人工诱导可使其形成感受态，吸收外源DNA，称人工转化。 化学转化（chemical transformation） 电转化（electrotransformation）,1、化学转化,化学转化是指对数生长期的细菌培养物，经过钙化学物质的处理后成为感受细胞，具有摄取外源性DNA的能力。 方法：Ca2+低渗休克处理、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO） 影响转化效率的因素： （1）必须是对数生长早期的细菌细胞。 （2）将细菌维持在冷的状态，避免剧烈混合。 （3）不同菌株的转化效率可明显不同。 （4）感受态细胞可在-70冻存。 （5）不同方法制备的感受态细胞，冰冻对转化效率的影 响不同。,2、电转化,DNA电转化又称电穿孔试验，对化学转化不成功的许多细菌、真核细胞等，用电转化试验获得成功。 原理：将细胞置于强电场中时，细胞膜被极性化，会产生跨膜电位差。当电位差超过阈值，在细胞膜上会暂时形成小孔，允许像DNA这样的外源性大分子进入。 电击对细胞的杀伤作用与细菌的生长周期、细胞密度、电击缓冲液的种类以及电压、电击时间等因素有关。以大多数细菌而言，所用的电击条件必须将50%或50%以上的细菌细胞杀死，才能使整个群体具有摄取外源性DNA的能力。 基因枪（Biolistic）转化,二、转 导,转导（transduction）是以噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的生物性状。 特点 绝大多数细菌都有噬菌体，因此转导作用较普遍。 噬菌体蛋白外壳可保护DNA不被外界的DNA水解酶破坏，较为稳定。,（一）噬菌体,噬菌体（phage）是侵染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 个体微小，没有完整的细胞结构 专性细胞内寄生，分布广泛 与宿主菌的关系具有高度特异性，可用于未知菌的鉴定和分型 在宿主菌中寄生和转移，引起基因的水平转移,1、噬菌体的生物学性状,形态与结构 个体微小，结构简单，需用电子显微镜观察。 头部：内含遗传物质核酸 尾部：帮助遗传物质注入细胞 尾髓：收缩功能，可使头部核酸注入宿主菌 尾领：与头部装配有关 尾板：内含裂解宿主菌细胞壁的溶菌酶 尾丝：吸附结构，能识别宿主菌表面的特殊受体,尾刺,尾丝,尾领,尾鞘,化学组成 核酸基因组 蛋白质衣壳 保护遗传物质 帮助侵染新的宿主 具抗原性，可刺激机体产生特异性抗体,抵抗力 对理化因素的抵抗力比一般细菌的繁殖体强，加热70-80经30min仍不灭活。 多数能抵抗乙醚、氯仿和乙醇，但对紫外线和X射线敏感，一般经紫外线照射10-15min即失活。 在低温下能长期存活，反复冻融并不减弱其裂解能力。 室温、4-8冰箱能保存6个月以上，在液氮中和冻干状态下能长时间保存。,2、噬菌体的生活周期,根据在宿主菌体内复制过程和生存状态的差异，分为 毒性噬菌体（virulent phage） 温和噬菌体 （temperate phage）,（1）毒性噬菌体生活周期,吸附（adsorption） 侵入（penetration） 核酸复制（nucleic acid replication） 噬菌体装配（phage assembly） 释放（release）,（2）温和噬菌体生活周期,许多噬菌体感染细菌后，不进入裂解循环，而是将其基因组整合到宿主菌染色体上或像质粒存在于细胞质中，随细菌DNA复制而复制，并随细菌的分裂而传代，细菌并不裂解，被称为温和噬菌体或溶原性噬菌体（lysogenic phage）。 整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为前噬菌体（prophage），带有前噬菌体的细菌称为溶原性细菌（lysogenic bacterium）。,（二）转导类型,普遍性转导（generalized transduction） 局限性转导（specialized transduction）,1、普遍性转导,通过噬菌体将宿主菌DNA的任何小片段转移至受体菌称为普遍性转导。 完全转导：外源性DNA片段