组织学与胚胎学(绪论)

组织学与胚胎学 Histology and Embryology 讲授者:费新法,第1章 组织学绪论(introduction) 一、组织学的内容和意义 何谓组织学？ 组织学是研究机体的细胞、组织、器官的微细结构及其相关功能的科学。如研究肺的微细结构与其行使呼吸功能的关系，肾的微细结构与其产生尿液的关系等。与解剖学比较，解剖学主要是用解剖的方法在系统和器官水平上研究机体的大体结构，而组织学则是利用显微镜等手段，在组织、细胞、亚细胞和分子水平上对机体进行研究，所以组织学又称为显微解剖学。,何谓组织（tissue）、器官和系统？ 由细胞群和细胞外基质共同组成的结构称为组织。 细胞是机体结构和功能的基本单位，细胞外基质 由细胞产生，位于细胞之间，又称细胞间质。, 由四大基本组织以不同的种类、数量和方式组合 在一起形成器官。 由若干个功能相关的器官构成一个系统。,学习组织学有何意义？ 结构决定了功能，学习组织学是为学习生理 学打基础。 正常的组织结构是异常的病理改变的对照标 本，只有掌握了“正常”，才能识别“异常”， 所以学习组织学也是为学习病理学打基础。,促进人类了解自身的微观世界。 掌握组织学的基本知识和技能（用显微镜观察标本的能力），为将来从事组织病理学方面的研究工作奠定基础。 二、组织学发展简史和当代组织学（自学） 三、组织学的学习方法 1.抓住特征性结构，由浅入深地剖析 机体各系统的主要器官，由于它们的功能不同，组织结构不一样。例如肺行使呼吸功能，其特征性结构是一系列的导气管道和肺泡。,而肾行使的是泌尿功能，它的特征性结构是肾小体和一系列泌尿小管。那么，器官的每一个特征性结构又是由什么组成的？有何功能？这就需要从组织细胞亚细胞分子水平，由表及里，由内到外，由浅入深予以剖析。,2. 注意形态与功能的统一 器官的主要特征性结构决定了它的功能，一个器官的结构是与其功能相适应的。如男性睾丸有产生精子的结构和分泌雄激素细胞，而女性的卵巢有产生卵子的结构和分泌雌激素的细胞，所以，在学习时要注意结构与功能的统一并互相提示，引起重视。,3. 学习时图文对照阅读 组织学主要是描述各器官的微细构造，配有模式图和真实的标本彩图。学习时注意将文字描述与插图对照阅读，加深理解和记忆。如肝小叶的微细结构及其相互关系图。,4. 理论联系实际，重视标本观察 理论来源于实践，科学的理论能指导实践。组织学的实验，是在理论的指导下，借助显微镜观察切片标本。学习正常的组织结构是为进一步学习病理组织改变打基础的，要认真观察各种微细结构及其比邻关系。,另外，应注意的是几乎所有的插图或切片看到的都是二维图形，而真实的结构是立体的，这就需要通过想 象思维将二维 图像还原为三 维构像。,四、组织学技术简介 组织学技术是指研究器官组织或细胞的手段和方法。其种类繁多，最常用的有光镜技术、电镜技术、组织化学术等。 （一）光镜技术 1. 石蜡切片术（paraffin sectioning） 其基本操作程序是： 取材固定脱水包埋切片染色, 取材和固定：取35mm3大小的新鲜组织，放置在 10%甲醛（福尔马林）固定液中固定，使蛋白质 凝固，以保持组织的原本结构。 脱水和包埋：用酒精脱水二甲苯脱酒精置于 溶解的石蜡中冷却成石蜡硬度组织块。 切片和染色：将包有组织的蜡块用切片机切成5- 10m的薄片，再将薄片贴于载玻片上，用二甲苯脱蜡，再用酒精除去二甲苯后染色。 最常用的是苏木精伊红染色法 （hematoxylin eosin staining）,简称H-E染色法。,苏木精为碱性染料，它的盐溶液带阳电荷，能将细胞核内的染色质和胞质中的核糖体染成紫兰色。伊红为酸性染料，它的盐溶液带阴电荷，能使细胞质和细胞外基质的成分染成红色。,何谓嗜碱性和嗜酸性？ 组织中的某些结构，易于被碱性染料着色的性质，称嗜碱性（basophilia），易于被酸性染料着色的性质，称嗜酸性（acidophilia）。 封片：薄片 染色后再经酒精脱水 和二甲苯透明，最 后滴点树胶，用盖 玻片密封保存。,2. 其它制片方法 火棉胶包埋：在制作较大组织块，如眼球、脑的 切片时用。 冷冻切片：将组织块 立即放置到液氮（-196） 内快速冻结，用恒冷箱切 片机（cryostat）制成冷 冻切片。这种方法对细胞 内蛋白质（包括酶）的结 构和活性保存良好，常用 于酶组织化学染色。, 涂片：将游离的细胞直接涂在玻片上染色， 如血液涂片。 铺片：将疏松结缔组织、肠系膜等撕成薄 片，铺在载玻片上。 磨片：将骨、牙等硬组织切割成片后再磨成 薄片。,3. 其它常用特殊染色法 镀银染色：如将神经组织切片标本浸泡在硝酸银溶液中，可将神经元染成棕黑色或棕黄色。 若将网状组织切片标本浸泡在氢氧胺银溶液中，再经5%甲醛液还原，能将网状纤维染成黑色，胶原纤维呈褐色。, 醛复红与偶氮焰红染色：醛复红能将弹性纤维 和肥大细胞的分泌颗粒染成紫色。胶原纤维呈红色。 活体染色：如将台盼兰从活体动物静脉注入后， 再取材制成切 片观察，可见 肝脾等器官内 的巨噬细胞胞 质中含有大量 兰色吞噬颗粒 而易于辩认。,4. 光镜的选用 普通光镜：一般用于观察上述方法制作的标本。 荧光显微镜（fluorescence microscope）：它以紫外线为光源， 能激发染料 发出荧光。 常用于观察 用荧光染料 染色或作标 记物的标本。,相差显微镜（phase contrast microscope）： 能将活细胞的不同厚度及细胞内各种结构对光线产生的不同折射，转换为光密度差异（明暗差），从而使镜下的各种结构反差明显，影像清晰。用于观察在细胞培养技术中无色透明的活细胞。,激光扫描共聚焦显微镜 以荧光显微镜为基础，以激光为光源，可检测标本内微弱的荧光，观察细胞或较厚组织的内部结构，用扫描系统逐层扫描可获得各层面的精细图像，经计算机处理可得到完整的三维图像。,（二）电镜技术 电子显微镜与一般光镜不同：以电子束代替可见光；以电磁透镜代替光学透镜；用荧光屏使电子束呈像；可将微细结构放大几万倍至几十万倍，分辨率可达0.2nm，而光学显微镜只放大约1000倍，最高分辨为0.2m。 1. 透射电镜术（transmission electron ycroscopy,TEM） 取材和固定：用戊二醛与锇酸两次固定，以保存细胞正常的超微结构。 脱水和包埋：用树脂包埋。 切片：用超薄切片机切片，切成厚约5080nm的超薄片。 染色：用醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子染色。,透射电镜带扫描附件, 可观察样品内部及表面的超微结构,超薄切片机, 电镜下观察：标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。当电子束投射到密度大、吸附重金属（铀、铅）多的结构（如溶酶体）时，电镜照片上呈黑色或深灰色，称高电子密度，反之，呈浅灰色的结构，称低电子密度。,2. 扫描电镜术（scanning electron mycroscopy,SEM） 用于观察组织、细胞表面的立体结构，分析物体的立体形象。,(1)样品制备： 取材后，将组织用戊二醛和锇酸固定，脱水后，放入真空镀膜仪内使组织干燥。 接着在组织表面先后喷镀一层碳膜和金属膜（一层金铂合金细颗粒），以提高组织的导电性和图像反差。 (2)扫描成像： 电子发射器 电子束（称一次电子） 标本表面扫描 产生散射电子（称二次电子） 探测器收集 形成电子信号 传到显像管 荧光屏显立体构像。如微绒毛、纤毛等立体图像。 (二次电子多的部位就亮，反之则暗。),（三）组织化学术（histochemistry） 1. 一般组织化学术 基本原理是在切片上加某种试剂，组织中的待检物质与试剂发生化学反应，形成最终产物或为有色沉淀物，用光镜观察。若为重金属沉淀，可用电镜观察。 组织中主要待检的物质有：糖类、脂类、核酸和酶类。 如显示糖类：常用方法是过碘酸希夫反应(periodic acid Schiff reaction, PAS反应 )。,基本原理是：,肝细胞PAS反应示糖原颗粒,2.免疫组织化学术（immunohistochemistry） 原理： 是根据抗原与抗体特异性结合的原理，检测肽和蛋白质的技术。由于抗原抗体反应在显微镜下难以看清楚，故在抗体上标记可呈色的物质，使抗原抗体反应清晰可见。,基本过程 抗原提取与抗体制备：用特殊方法分离、纯化人或动物组织的某种蛋白质（如细胞膜抗原）作为抗原。将抗原注入另一种动物体内，其体内会产生针对该抗原的抗体（免疫球蛋白）,再从动物血清中提取该抗体，并用荧光素、辣根过氧化物酶或胶体金标记，成为标记抗体。 标记抗体与抗原结合：用可呈色的标记抗体与组织切片或细胞浮育，抗体则与相应的特异性抗原结合。在显微镜下观察抗体的标记物就知道某种肽或蛋白质的分布部位。,图10 免疫组织化学原理模式图,呈色情况与观察： 常用的荧光素是异硫氰酸荧光素发出黄绿色荧光，四甲基异硫 氰酸罗丹明发出橙 红色荧光。 (见图14), 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）,它的底物是3，3-二氨基联苯胺（DAB）和H2O2。HRP能使DAB氧化形成棕黄色产物。, 胶体金标记多用于电镜观察。,3. 原位杂交术（in situ hybridization） 原位杂交术，又称核酸分子杂交组织化学术，它是通过检测细胞内mRNA和DNA序列片段，原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。 基本原理及步骤： 制备带有标记物的已知碱基顺序的核酸(DNA或 RNA片断)探针。 将探针与组织或细胞共同浮育，使探针与组织 细胞中互补核酸单链结合，即分子杂交。 通过标记物的显示，在光镜或电镜下观察、分 析待测DNA序列或RNA的有无及相对量。, 常用的探针标记物： 放射性核素，如35S，32P，3H(氚)等，经放射 自显影技术处理后观察。 地高辛，经免疫组织化学处理后观察。 图：原位杂交(地高辛标记) 大鼠主动脉平滑肌细胞表达弹性蛋白mRNA，胞质呈综黄色。, 核酸探针的制备： 应用DNA合成仪合成寡聚核苷酸探针。,DNA合成仪(美国PE8909型)用于合成DNA,（四）放射自显影术（autoradiography） 基本原理： 是利用活细胞对放射性物质的特异性摄入，以显示该物质在组织和细胞内的代谢过程及细胞的功能状态。 利用放射性同位素在蜕变中发射出高能量射线，能使核子乳胶（或照相底片）感光的原理而形成影像观察。 （放射性核素有3H、35S、32P、131I等）,基本过程 放射性核素或其标记物 注入动物体内 取材切片 标本涂感光乳胶 放射性核素发出高能量射线 乳胶中溴化银还原 成黑色微细银粒 标本置黑暗处曝光 显影剂显影定影 光镜或电镜观察 黑色影像分布及强度 从而获知放射性核素或其标记物在组织和细胞中的分布及相对含量。 在注入核素标记物后，如果有规律地在若干时间段取材，则可观察到被检物质的动态分布过程。,例如，将3H标记的胸腺嘧啶核苷注入动物体内，以研究细胞的DNA合成及细胞的增殖活动。 又如将125I注入体内，观察碘在甲状腺滤泡内的碘化部位。,（五）图像分析术（image analysis） 又称形态计量术（morphomety），是应用数学和统计学原理，对组织切片提供的平面图像进行分析，从而获得立体的组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等参数。如肺泡的数量和表面积、肾小体的数量和体积、胰岛的数量及其各种细胞的百分比等，这些数值从量的角度显示了结构与功能的关系。在病理情况下，由于“量”的减少，功能必然降低。,用图像分析仪检测,显微图像分析系统,图像分析仪（image analyser ）又称图像分析系统（image analysis system）。能将光镜下的标本图像传到摄像机