微生物的营养及消毒灭菌

项目一 微生物的营养及消毒、灭菌,模块二 微生物基本操作技术,一、微生物的营养要素 二、培养基的 配制 三、消毒与灭菌,1.化学元素: 大量元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁（其中前六种占细菌细胞干重的97%）。 微量元素: 锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍 、硼。,（一） 微生物细胞的化学组成,一、 微生物的营养要素,主要以水、有机物、无机盐的形式存在于细胞中： （1）有机物：蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素及其降解产物 （2）无机物：1)参与有机物组成。 2)单独存在于细胞质内以无机盐的形式存在。 （3）水：约占细胞总重70%90%，以游离水和结合水两种形式存在 游离水：干重法可测得； 结合水：不易蒸发、不冻结、也不能渗透,占水总量的17%28% 。,2.元素在细胞内存在形式：,（二） 微生物的营养要素及其生理功能,定义：凡可被用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。,功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生物）。 种类: 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、麸皮、米糠等；饴糖；单糖）,脂类、醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含碳的化合物。,1.碳源,微生物的碳源谱,传统种类：糖类（单糖，饴糖） 淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等） 麸皮、各种米糠等 代粮发酵：纤维素、石油、CO2、H2,异养微生物：必须利用有机碳源的微生物 自养微生物：利用无机碳源作为主要碳源的微生物,微生物工业发酵中用做碳源的原料,用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养源。 种类：无机氮：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、氨、N2 有机氮：蛋白质及其降解产物（如胨、肽、氨基酸等）、牛肉膏、鱼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆等 功能： 1）提供合成细胞中含氮物，如蛋白质、核酸，以及含氮代谢物等的原料； 2）少数细菌可以铵盐、硝酸盐等氮源为能源。,2.氮源,微生物的氮源谱,实验室常用的氮源有碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。 生产上常用的氮源 硝酸盐、铵盐、尿素、氨以及蛋白含量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼份、玉米浆等。,定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式供给。 大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L） 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）,一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。,3.无机盐,无机盐的生理功能：,定义:是一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。,4.生长因子,生长因子主要类型： （1）维生素 （2）氨基酸 （3）嘌呤与嘧啶,水的生理功能：生命存在的必要条件,水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。 不同细胞及不同细胞结构中游离水的含量有较大差别：,5.水,培养基：人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的混合养料。 特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。,用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品。,二、培养基的配制,培养基是人工配制的、适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 它是进行科学研究、发酵生产微生物产品的基础。 培养基的成分和比例对微生物的生长发育、代谢及产物积累有着极大影响。,（一）培养基的类型及其应用,1.根据对培养基成分的了解程度分 天然培养基：以天然有机物配置而 成的培养基。 合成培养基：所有成分都是已知的 纯化学物质。 半合成培养基：由部分天然材料和 部分已知的纯化学药 品组成的培养基,2.根据培养基的物理状态分 固体培养基：含有凝固剂而呈固体状态的培养基。 常用的固体培养基的凝固剂有琼脂、明胶等。 半固体培养基：半固体培养基中的琼脂加入量约 0.20.5，硬度低。用于细菌 的动力观察、厌氧菌的培养等。 液体培养基：液体培养基中不加入琼脂，培养基 组分均匀分布。常用的液体培养 基有麦芽汁、营养肉汤等。,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,主要用于微生物的分离、计数等,主要用于观察微生物的运动、鉴定菌种等,主要用于工业生产,需加入凝固剂，如琼脂,3.按用途划分,（二）培养基的配制方法和步骤,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签,注明何种培养基。 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。, 配制培养基应注意的问题 、考虑碳源、氮源时，要注意快速利用碳氮源和慢速利用碳氮源的相互配合，发挥各自优势，避其所短。, 配制培养基应注意的问题 、选用适当的碳氮比。 C源 做为C架又做能源，碳源较氮源多。 过多，容易形成较低pH。 不足，菌体衰老和自溶。 N源 作营养和氨基的来源过多，菌体生长 过于旺盛，pH偏高，不利 于代谢产 物 的积累。不足，菌体繁殖量少，从 而影响产量。,碳氮比不当，还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物的形成，菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求是不一样的。 根据元素组成：酵母菌的碳氮比约为10020；霉菌的碳氮比约为10010。,3、要注意生理酸性盐、生理碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。 生理酸性盐：如(NH4)2SO4为氮源时，由于NH4+被吸收，而造成培养基p降低。 生理碱性盐：如以KNO3为氮源时，由于硝酸根被利用，会引起培养基p值的升高。 工业生产中常用无机氮源有氨水或尿素作为氮源。, 配制培养基应注意的问题,能作为细菌培养用培养基碳源、氮源及生长因子的物质有哪些？, 常用的碳源,葡萄糖：纯葡萄糖、淀粉水解液 乳糖： 纯乳糖、乳清粉 淀粉：大麦、大米、燕麦粉、黑麦粉、 玉米、野生植物、薯类等 蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、 精白糖 另外还有醋酸、乙醇、亚硫酸纸浆废液、食品工厂的下脚料等等。, 常用的氮源 工业生产中常用有机氮源豆饼粉、花生饼粉、麸皮或麸皮水解液、玉米浆等。 根据：现有的工艺条件 菌种生长和合成产物时pH的变化 最适pH的控制范围 综合考虑选用生理酸碱性物质及用量，从而保证在整个微生物生长过程中pH都能维持在最佳状态。,生长因子 维生素、氨基酸、生物素、甘油、油酸、嘌呤、吡啶 其他农副产品，如玉米浆、麸皮水解液、糖蜜,（三）常用培养基：,1、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 （是一种应用广泛和普通的细菌培养基） 配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 氯化钠 3g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 1.05kg/cm2，2530min,2、高氏1号培养基 是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。 3、查氏培养基 主要用来培养霉菌并进行形态观察的合成培养基。 4、马丁培养基 是一种用来分离真菌的选择性培养基。 5、马铃薯培养基 被广泛用于培养酵母菌和霉菌的半合成培养基。,三、消毒与灭菌 （一）基本概念 （二）物理消毒灭菌法 （三）化学消毒灭菌法,抑菌（防腐） ：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。 消毒：杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。 杀菌：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。 化疗：是指利用某些具有选择毒性的化学药物或抗生素对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体。,（一）基本概念,（二）、物理消毒灭菌法 1、干热灭菌法 2、湿热灭菌法 3、滤过除菌法 4、辐射灭菌法,（1）灼烧法 这是最简单、最彻底的干热灭菌方法，它将被灭菌物品放在火焰中灼烧，使所有的生物质碳化。 接种针、勺、试管或三角瓶口和棉塞的灭菌。,1、干热灭菌法,（2）烘箱热空气法,将物品放入烘箱内，然后升温至150170，维持12小时。一般的营养体在100，维持1小时即会死亡，芽孢在160，维持2小时才会全部死亡。所以，经过烘箱热空气法可以达到彻底灭菌的目的。该法适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌。,（1）巴氏消毒法,61.162.8 30min 71.7 1530秒 杀死液体中的病原菌或某些特定微生物 消毒牛奶、酒类等食品,2、湿热消毒灭菌法,巴斯德,（2）煮沸消毒法,煮沸100经5min可杀死一切细菌的繁殖体，一般消毒以煮沸10min为宜 芽胞需1-2小时才能杀死 用于一般外科器械、胶管和注射器、饮水和食具的消毒,（3）间歇灭菌法,利用蒸汽反复几次进行灭菌。100，维持3060分钟，以杀死微生物的营养体，冷却后，于37培养一天，次日同法灭菌，如此反复3次，即可达到灭菌的目的。 主要应用于一些不宜于高压灭菌的培养基，如糖类、明胶、牛奶等的灭菌。,（4）连续灭菌法 100，处理8小时，达到杀灭微生物及芽孢的目的。,（5）高压蒸汽灭菌法,压力：1.05kg/cm2 温度：121.3 时间：1530min 效果： 杀死一切微生物，包括芽胞 耐高热、不怕潮湿的物品,3、滤过除菌,主要用于一些不耐热的血清、毒素、抗生素、药液以及空气等除菌。 不能除去病毒、支原体等 常用的除菌滤器 蔡氏滤器 玻璃滤器 薄膜滤器,（1）紫外线灭菌 日光和紫外线 杀菌波长：240300nm，最适：260266nm 杀菌机制：紫外线能干扰DNA的复制，导致细菌死亡或变异。 用于物体表面和空气消毒,4、 辐射消毒法,（2）射线灭菌 射线、高能量的电子束（阴极射线） 不升高温度且穿透力强 适于忌热物品的灭菌或消毒,(3)微波灭菌法 频率在300兆赫到300千兆赫之间的电磁波 可穿透介质较深 ，表里一致地均匀加热 常用于消毒、灭菌包装好的物品,1、常用消毒剂的杀菌机制,（1）使菌体蛋白变性或凝固 （2）干扰微生物酶系统和影响其代谢 （3）损伤细胞膜，提高其通透性,(三)灭菌和消毒的化学方法,酚类：,2、常用消毒剂的种类、作用机制与用途,醇类：,重金属盐类：,氧化剂类：,表面活性剂类：,烷化剂类：,染料类：,酸碱类：,