小鼠精子畸形试验及判定结论

小鼠精子畸形试验一、目的与要求1. 熟悉精子畸形的概念及类型、精子畸形试验的实验设计、试验检测的遗传学终点。2. 学习和掌握小鼠精子畸形试验的基本方法步骤，正常精子及畸形精子的镜下观察。3. 了解精子畸形试验数据整理、分析方法及结果的评价。二、实验原理精子的畸形主要是指精子形态的异常改变，大、小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。因此精子形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。大、小鼠精子畸形试验可检测受试物对于精子生成、发育的影响，而且对已知的生殖细胞致突变物有高度敏感性，故精子畸形试验可用作检测受试物在体内对生殖细胞的致突变作用。三、实验设计1. 动物选择：一般采用小鼠，因为小鼠比较经济，且有大量的实验结果证实小鼠在该实验系统中对受试物最为敏感。68周龄（体重2535g），雄性。每组应保证至少有5只存活小鼠。2. 染毒途径：多用腹腔注射，也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，如经口、吸入及皮肤接触等。3. 染毒次数及取样时间：可采用1次或每天1次连续5天的方法进行染毒。各种化学毒物作用于精子的不同发育阶段，可在接触某种化学毒物后不同时间出现精子畸形，故有条件时，可于给受试物后第1、4、10周处死动物，检查精子形态。因为大部分化学毒物对精原细胞后期或初级精母细胞早期的生殖细胞较为敏感，故一般均是于首次给受试物后的第35天处死。4. 剂量选择：至少设置3个剂量组。最高剂量组5天总剂量应能使部分动物死亡，一般可取1/2 LD50为高剂量组，然后以1/21/4递减作为中、低剂量组。另设溶剂对照组（阴性对照组）和阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺（20 mg/kg）或甲基磺酸甲酯（75 mg/kg）或甲基磺酸乙酯（60 mg/kg）进行腹腔注射，每天1次，连续5天。四、操作步骤1. 制片颈椎脱臼处死小鼠，取出双侧附睾，将附睾放入1 ml磷酸盐缓冲液或生理盐水中。用眼科剪将附睾纵向剪12下，静止35 min，轻轻摇动。用4层擦镜纸或合成纤维血网袋滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片一端，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min以上，自然晾干。用1 %2 %伊红染色1小时，用水轻冲，干燥。2. 阅片在低倍镜下找到背景清晰、精子重叠较少的区域，然后用油镜计数。每只小鼠为一观察单位，计数1000条完整的精子中畸形精子数，计算各组小鼠精子畸变率。其中有头无尾（轮廓不清）、头部与其他精子或碎片重叠及人为剪碎的精子均不计算。精子畸形主要表现在头部，其次为尾部，可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。异常精子均应记录显微镜的坐标数，以备复查。并分别记录异常类型，以便统计精子畸形率及精子类型的构成比。判断双头、双尾畸形时，要注意与两条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。五、结果分析及评价每只动物应按精子畸形类型分别记录，以便计算各实验组的精子畸形发生率（百分率）和精子畸形类型的构成比。利用Wilcoxon秩和检验法和其他适当的统计学方法。将受试物各剂量组精子畸形发生率分别与阴性对照组进行比较。在结果判断时，首先要注意假阳性结果的排除。某些因素可导致机体出现精子畸形率的增高，如变态反应、感染、缺血和体温升高等。不同品系的小鼠的精子畸形率本底差异值较大，而且影响的因素比较多，故在结果分析时，应该首先观察阳性和阴性的实验结果。阳性对照组精子畸形率的增高应该在实验室的历史记录或文献报道的范围之内，并与阴性对照组的差异具有统计学上的意义；阴性对照组的精子畸形率也应与自己实验室的历史记录或文献报道相接近，否则实验结果可信性较差，需重复试验。一般正常小鼠的精子畸形率为0.8%3.4%，但每个实验室应有自己稳定的精子自发畸形率。精子畸形试验的阳性的判断标准是精子畸形发生率至少为阴性对照组的两倍或经统计学处理有显著性差异，并存在剂量-反应关系者。或者至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率达到阴性对照组的两倍或经检验差异具有统计学上的意义，并且实验结果能够进行重复。如果实验组的染毒剂量已经使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验为阴性结果。如有以下情况，试验必须重做：剂量-反应关系不确定；精子畸形率仅在一个剂量组升高。