河南科技大学微生物工程学幻灯片第四章发酵工艺的控制

,发酵工艺的控制,第四章,工艺条件控制的目的：就是要为生产菌创造一个最适的环境，使我们所需要的代谢活动得以最充分的表达。,一、温度对发酵的影响及控制,1，影响发酵温度的因素 产热因素：生物热 搅拌热 散热因素：蒸发热 辐射热,发酵热,发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射,生物热：生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2,NH3时释放出的大量能量。 用途：合成高能化合物， 供微生物生命代谢活动 热能散发 影响生物热的因素：生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系。,实验发现抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号的生物热。说明抗生素合成时微生物的新陈代谢十分旺盛。,1、抗生素相对活性为1 2、抗生素相对活性为0.5,发酵过程中生物热的变化,搅拌热：通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间，液体与设备之间的摩擦而产生的热 。 Q搅拌=3600（P/V） 3600：热功当量（kJ/（kW.h） （P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（ kW/m3）,蒸发热：通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。同时必然会引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。 蒸发热的计算： Q蒸发=G（I2-I1） G：空气流量，按干重计算，kg/h I1 、 I2 ：进出发酵罐的空气的热焓量，J/kg（干空气）,辐射热：由于发酵罐内外温度差，通过罐体向外辐射的热量。 辐射热可通过罐内外的温差求得，一般不超过发酵热的5%。,影响各种酶的反应速率和蛋白质性质 影响产物质量 影响生物合成的方向 例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。,2，温度对发酵的影响,最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。 最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。 最适发酵温度的选择 在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。 温度的选择要参考其它发酵条件。 温度的选择还应考虑培养基成分和浓度,3，最适温度的确定,发酵罐：夹套（10M3以下） 盘管（蛇管） （10M3以上）,4，温度的控制,二、 pH对发酵的影响及控制,发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。 尽管多数微生物能在34个pH单位的pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。,1，pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响,pH影响酶的活性 pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态 pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解 pH影响菌体代谢过程，使代谢产物的质量和比例发生改变,2，发酵过程中pH的变化,生长阶段：pH有上升或下降趋势（相对于接种后起始 pH而言） 生成阶段：pH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围。 自溶阶段：随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培 养液中氨基氮增加，致使pH上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止。,碳源过量，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降。 消泡油添加过量 生理酸性物质的存在（NH2SO4），氨被利用，pH下降,3，引起pH下降的因素,氮源过多, 生理碱性物质的存在（NaNO3）， 中间补料，氨水或尿素等碱性物质的加入过多使pH上升。,4，引起pH上升的因素,原则：有利于菌体生长和产物的合成。一般根据实验结果确定。 最适pH与菌株，培养基组成，发酵工艺有关。应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。,5，最适pH的选择,最适pH与微生物生长、产物形成的四种类型： 菌体比生长速率和产物比生产速率QP的最适pH在一个相似的较宽的范围内（比较容易控制）； 较宽， Qp范围较窄，或较窄， Qp范围较宽（难控制，应严格控制）； 和 Qp对pH都很敏感，其最适pH相同（应严格控制）； 更复杂，和 Qp对pH都很敏感，并有各自的最适pH（难度最大）；,调节基础培养基的配方 调节碳氮比（C/N） 添加缓冲剂，例如加入轻质CaCO3 补料控制 直接加酸加碱 补加碳源或氮源，例如可以根据生产菌的代谢需要用改变加糖速率来控制pH, 也可通过中间补加尿素或硫酸铵等调节,6， pH的控制,大多数发酵过程是好氧的。 氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右(氧在水中的饱和度约为l0mg/L) 。许多发酵的生产能力受到氧利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。,三、氧对发酵的影响,生长于不同基质上的不同微生物的需氧要求,1.临界氧浓度（C临）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。,Dissolved Oxygen Concentration,QO2,Ccritical, 某些微生物的临界氧浓度,2、溶氧对发酵的影响,溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢受到干扰。 发酵工业的目标是要得到菌体发酵的产物而不是菌体本身。因此，由氧饥饿而引起的细胞代谢干扰，可能对形成某些产物是有利的。 当提供的氧浓度远大于临界值时，虽对菌体形成无妨，但也许能刺激产物的形成。 某种产物形成的最佳条件可能不同于菌体生长的最佳通气条件。,根据需氧不同，可将初级代谢发酵分为： a. 供氧充足条件下，产量最大；若供氧不足，合成受强烈抑制； 如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等 b.供氧充足条件下，可得最高产量；若供氧受限，产量受影响不明显； 如：异亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸等 c.若供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才获得最大量产物；若供氧充足，产物形成反而受抑制； 如：亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸等,但在实际生产过程中需注意： 溶解氧浓度过低（代谢异常，产量降低） 溶解氧浓度过高（代谢异常，菌体提前自溶）,3、发酵过程的溶氧变化,发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降 发酵中后期，溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等 发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升,4、溶氧的控制,调节通风与搅拌 限制基础培养基的浓度，使发酵器内的生物体浓度维持于适当水平；并以补料方式供给某些营养成分而控制菌体生长率和呼吸率。,四、发酵过程中的泡沫及其控制,1，泡沫的性质 泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。发酵过程中所遇到的泡沫，其分散相是无菌空气和代谢气体，连续相是发酵液。,一类存在于发酵液的液面上，这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辫的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见到的。 另一种泡沫是出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。,2，泡沫的类型,由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌） 发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）。,3，泡沫产生的原因,降低发酵设备的利用率 增加了菌群的非均一性 增加了染菌的机会 导致产物的损失 消泡剂会给后提取工序带来困难,4，泡沫对发酵的不利影响,通气与搅拌的强度 培养基的配比及原材料组成 培养基的破坏程度 接种量的大小 培养液本身性质的变化 染菌,5，影响泡沫稳定的因素,不同搅拌速度和通气量对泡沫影响,不同浓度蛋白质原科的起泡作用,灭菌时间对泡沫稳定性的影响,6，发酵过程泡沫的变化,7，发酵过程泡沫控制的方法,物理消沫法 化学消沫法,物理消泡法,方 法 罐内消沫法： 罐外消沫法：,原 理 靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。,优 点 不需要引进外界物质、节省原材料、减少污染机会,缺 点 不能从根本众消除引起稳定泡沫的因素。,化学消泡法机理,当泡沫的表层存在着由极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。 当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。,消泡剂的种类和性能,天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油等。 聚醚类：在生产上应用较多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又称泡敌)。 高级醇类：十八醇是较常用的一种，可以单独或与载体一起使用。 硅酮类：硅酮类消沫剂主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。, 纯种发酵（单菌或混菌）；菌种以外的微生物都被视为杂菌。 所谓染菌，是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。 几乎所有的发酵工业都有可能遭遇杂菌或噬菌体的污染。染菌的结果，轻者影响产量或质量，重者可能导致倒罐，甚至停产，造成原料、人力和设备动力的浪费。,五、 杂菌的防治,一、杂菌污染的原因与防治,1、 从染菌的现象分析染菌的原因,1）从染菌的时间分析, 早期（如接种后12 h或24 h），除了种子带菌外，主要是培养基或设备灭菌不彻底。 相反，中、后期染菌则可能与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关，也可能是空气过滤器不严所致。,2）从污染的杂菌类型分析, 污染耐热的芽孢杆菌，多数是因培养基灭菌不彻底或设备存在死角所致； 污染无芽孢杆菌、球菌等不耐热菌，可能是从蒸汽的冷凝水中带来的，或空气系统不严造成。,3）从发酵罐及批次分析,大批发酵罐染菌是指整个工厂各个产品的发酵罐都出现杂菌现象，而且染的是同一种菌，主要是空气过滤器除菌不净，空气带菌而造成的。,个别发酵罐连续染菌，较多地是由于设备问题而造成的。如阀门的渗漏或罐体破损，特别是蛇形管的穿孔，有时不易察觉。有时设备破损引起的染菌会出现每批染菌时间前移现象。,个别发酵罐偶然染菌的原因最为复杂，各种染菌途径都有可能引起。,根据谷氨酸发酵情况分析，染菌原因以设备问题（设备渗漏、管道不严、设备死角）和空气问题（过滤器不严、过滤器失效、过滤器受潮）为主，种子（二级种子染菌）次之，而培养基消毒不透的情况较少。,2、 防止染菌要点,（1）空气系统,提高空压机进口空气的洁净度、防止空气带油、水及过滤器失效。 如提高空压机吸气口位置并加强压缩前的过滤；防止空气冷却器漏水而进入空气系统；在空气过滤器灭菌时要防止冲翻介质而短路，防止烤焦介质或着火；装填纤维介质时要压紧；操作中要防止空气的压力剧变和流速激增等。,（2）设备, 发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。与物料、空气、下水道连接的阀门皆需保证严密度。 用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。 连消设备的连消塔要简单，易拆装清理，操作时蒸汽能与物料均匀混合，并易控温度；维持罐在料液输送时培养基在罐中能均匀地缓慢上升，不走短路。,（3）工艺操作, 空罐准备 放罐后应进行全面检查和清洗。蛇管和夹层要按设计规定的压力定期试压。空消时应先将罐内空气排尽，保持蒸汽畅通，阀门、管道均要彻底灭菌。, 实罐灭菌 配制培养基时要防止原料结块。配料罐出口应有筛板过滤器（筛孔直径0.5mm），以防块状物及异物进入罐内。灭菌时，要保证各路进气畅通及罐内料液翻腾激烈，控制好温度与压力，严防泡沫冒顶及料液倒流到空气系统中。, 补料 补入发酵罐内的料液一定要保证无菌。, 种子 有关种子操作的制度要严格遵守；摇瓶瓶塞要确保严密。, 无菌试验 无菌试验要严格取样操