微生物遗传变异和育种 (2)课件

第八章 微生物的遗传变异和育种,微生物学,北方民族大学,工业微生物菌种的筛选,理想的工业发酵菌种必须具有下述特性:,1.纯培养物; 2.遗传性状稳定; 3.生长速度快; 4.能利用廉价、来源广、成分简单的培养基； 5.忍耐不良环境能力强; 6.快速生产目的产物.,是工业微生物技术的关键和基础.,学习本章的目的,微生物菌种的获得, 微生物的自然分布,土壤中的大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源。, 微生物菌种获得的途径,菌种的来源,工业微生物的直接来源,向菌种保藏机构索取有关的菌株,微生物菌种分离筛选过程,（一）微生物样品的采集： 1.土壤采样:土壤有机质含量和通气状况;土壤的纵剖面;土壤pH;表面的植被;地理条件;季节条件. 2.根据微生物生理特点采样 微生物的营养需求和代谢类型与其生长的环境有很大相关性; 具有特殊性质的微生物的筛选; 海洋微生物能够产生不同于陆地来源的特殊代谢物. (二)富集培养 概念: 控制因素:,酪素培养基,淀粉培养基,我们学习的目的与方法,微生物遗传学基础,遗传与变异的几个概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。 遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。 遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件 表型 表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（突变频率一般为10-610-10）；b.形状变化的幅度大； c. 变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。 饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。,例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力。,微生物作为模式生物的生物学特性,由于微生物有一系列非常独特的生物学特性，因而在研究现代遗传学和其他许多重要的生物学基本理论问题中，微生物成为最热衷的研究对象。如：个体微小，结构简单；营养体一般都是单倍体；繁殖快；易于累积不同的中间代谢物；菌落形态可见性与多样性等。,第一节 遗传变异的物质基础,一、遗传物质化学本质的确定3个经典实验,肺炎链球菌转化实验DNA作为遗传物质 噬菌体感染实验DNA是遗传物质 植物病毒重建实验RNA是遗传物质,肺炎链球菌转化实验,（一） DNA作为遗传物质,肺炎链球菌的转化现象,Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性,DNA是转化所必需的转化因子,分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶 作用于有毒的S型菌细胞抽提物,转化实验：Griffith,能从上面得出什么结论？,转化原理：1944年Avery等离体条件下的转化实验,DNA作为遗传物质的第一个实验证据,（二）噬菌体感染实验,噬菌体感染实验,（三）植物病毒重建实验,植物病毒重建实验,结论,以上3个具有历史意义的经典实验，得到了一个确信无疑的共同结论： 核酸是负载遗传信息的物质基础,朊病毒的发现与思考,亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为 发现该蛋白内含有核酸。,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为 PrP sc所致，而这两种蛋白质的一级结构并没有改变。,人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等,羊搔痒症(scrapie),牛海绵状脑病(spongiform encephalopathy),引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病,Prusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒 （proteinaceous infectious particle），并将之称做Prion或Virino。 -朊病毒,1997年，Stanley B. Prusiner荣获诺贝尔奖,二、 遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）核酸存在的七个水平 细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核 细胞核水平: 原核与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA 染色体水平: 倍性(真核)和染色体数 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链 基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译 密码子水平： 信息单位,起始和终止, 核苷酸水平： 突变或交换单位，四种碱基,2）基因组上遗传信息具有连续性；,基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数,微生物基因组DNA绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制 起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别和结合的位点等 信号序列。,一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。,真核生物基因组的一个重要 特点就是含有内含子,个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列,3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；,4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；,5）基因组的重复序列少而短；,古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统(复制、 转录和翻译)则与细菌不同而类似于真核生物。,操纵子（operon）： 功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组 共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。,真核生物的基因结构,原核生物和真核生物的基因组比较,规范化表示,（二）原核生物的质粒,（1）质粒的定义,（2）质粒的特点,（3）质粒在基因工程中的应用,应用的最广泛的质粒载体是pBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记,pBR322 质粒图谱,（4）质粒的分离与鉴定(自学),质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。,对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。,特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。,（5）质粒的种类,（6）典型质粒的简介,F质粒 R质粒 Col质粒 Ti质粒 Ri质粒 Mega质粒 降解性质粒 隐秘质粒,F质粒,R质粒,一种可通过接合而转移的R因子的形成 (IS因子是转座因子，它可使RTF质粒和r决定质粒结合),Col质粒,Ti质粒,Ri质粒,Mega质粒和降解性质粒,隐秘质粒,酵母2um质粒 不显示任何表型，只有通过物理方法发现。,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变,某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。 在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。,(一)基因突变的类型,指由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。,指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异（L型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等，一般也属非选择性突变。,通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株,由于基因突变而使原始菌株产生了对某种抗性的变异类型。 抗性突变型普遍存在，例如对各种抗生素的抗药性菌株等。 化学药物或致死物理因子 抗生素、紫外线 正选择标记 （突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的 平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。） 表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示 strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性,选择性基因突变 能用选择性培养基（选择性条件）快速选择出来的突变株 营养缺陷型 抗性突变型 条件致死突变型 非选择性基因突变 形态突变型 抗原突变型 产量突变型,突变率(mutation mate)指生物在一个世代中在特定条件下发生某一突变的几率。 也就是突变体占该世代个体的比例。 亦可用每个单位群体在每个世代中产生突变株的数目来表示。常为10-6-10-9 一般突变是独立发生的。突变的基因不会影响其它基因的突变率 双重突变的几率是各个突变几率的乘积,(二) 突变率,（三）突变的特点,稀有性 独立性 诱变性 稳定性 可逆性 自发性 不对应性,第八章 微生物的遗传变异和育种,自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在10-6-10-9之间。,突变的发生一般是独立的。某一基因的突变，既不提高也不降低其他任何基因的突变率。,通过诱变剂的作用，可以提高上述自发突变的几率，一般可提高10-105倍。,由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新的变异性状也是稳定的、可遗传的。,任何性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变，几率相同,各种性状的突变可在没有人为的诱变因素处理下自发地产生。,突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。容易引起争论的问题,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,变量试验,涂布试验,影印培养试验,1变量试验,1943年Luria和Delbruck根据统计学的原理，设计了实验,Salvador Luria,Max Delbruck,(在同一个大管中作整体培养),3 7 1 4 4 3 5,抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数,变量试验,2、涂布试验,1949年,Newcombe 与变量试验相似,但方法更为简便 固体平板培养法,涂布试验,3、影印培养(replica plating)试验,1952年,Lederberg夫妇 设计了一种更为巧妙的影印培养法,直接证明了微生物的抗药性突变是自发产生,与相应的环境因素毫不相关的论点。,Joshua Lederberg,1958年Lederberg获诺贝尔生理学医学奖,影印培养法,影印培养试验,结论,基因突变是自发的，有不对应性,（五）突变及其机制（了解）,基因突变的原因是多种多样的,它可以是自发的或诱发的。 诱变又可分为点突变和畸变。,1、诱发突变,诱变：利用物理、化学或生物因素能显著提高基因自发突变频率的手段。 诱变剂(mutagen)：凡能显著提高突变频率的理化因子。 诱变：碱基对的置换 移码突变 染色体畸变,（1）碱基对的置换,DNA一种微小的损伤，典型的点突变，它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。 置换又可分为两个亚类: 转换：一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换; 颠换：一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 。,导致置换的诱变剂,直接置换的诱变剂： 直接与核酸碱基发生化学反应，不论在机体内或在离体条件下均有作用。 种类很多,例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂(硫酸二乙酯,甲基磺酸乙脂,N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍,N-甲基-N-亚硝基脲,乙烯亚胺,环氧乙酸,氮芥等)。,间接置换的诱变剂： 作用：通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中引起的,故是间接的。 引起这类变异的诱变剂是一些碱基类似物,如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤