应用基因工程课件

应用基因工程,什么是基因工程,分子水平 提取/合成生物的遗传物质：DNA(基因）/RNA生物供体 体外切割与载体拼接DNA重组 重组DNA引入受体细胞或生物体，使这种外源DNA（基因）复制与表达 又称遗传工程、DNA重组技术、分子克隆、基因克隆,什么是基因工程药物,基因工程 制备 具有疾病治疗或预防价值 重组蛋白质/多肽 DNA或RNA,根据人类的需要 繁殖基因、或表达其产物、或创造新性状 并稳定遗传给下代,人类细胞,细胞核,一、基因的获取,染色体被切成小片段，鉴定“目的基因”,染色体片段,目的基因,含有目的基因的片段,聚合酶链式反应（PCR）,1985年Mullis发明PCR（polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法 模仿体内DNA的复制过程首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。 重复此过程，DNA以指数方式扩增,PCR原理示意图,二、切割DNA的酶 限制性内切酶,限制性内切酶（II型） 特异识别和切割4-8个bp长度且具有回文序列的DNA片段 数百种 产生粘性末端,三、连接DNA的酶 DNA连接酶,将目的基因与载体连接起来，完成基因重组的过程“重组质粒” “载体”：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具 表达载体与克隆载体 细菌、酵母、植物细胞、动物细胞,四、导入/表达,重组DNA（重组质粒）导入受体细胞（生物体），目的基因得以复制和表达,细 菌,酵 母,植 物 细 胞,动 物 细 胞,基因枪,绿色荧光蛋白（GFP）,基因工程在工业领域的应用,环保工业残留农药降解、降解石油 酶制剂工业 食品工业 化学与能源工业,基因工程在农业领域的应用,农作物新品种抗寒、抗旱、抗盐碱、抗病 除草剂 转基因动物、转基因植物,基因工程在医药领域的应用,基因工程药物转基因植物、转基因动物 基因诊断和基因治疗,转基因植物,传统的杂交技术,基因工程技术,一、农作物基因工程,（一）抗虫转基因作物 （二）抗病毒作物 （三）抗细菌和真菌作物 （四）抗除草剂转基因作物,（一）抗虫转基因作物,苏云金杆菌（BT）毒素蛋白：苏云金杆菌（Bt）产生的毒素蛋白 有高度特异杀鳞翅目昆虫的活性 毒素蛋白被摄食进入昆虫中肠，在昆虫的中肠消化酶的作用下，原毒素降解成有毒性的多肽，结合到中肠上皮细胞表面的特异受体上，致使细胞膜产生一些穿孔，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞的肿胀裂解，最后导致细胞死亡,苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因,抗病基因抗虫基因优质基因,（二）抗病毒作物,植物病毒感染后，被感染的植株常出现矮化、枯死；被感染的叶子常出现花叶（斑点叶、黄叶）、卷叶或畸形 经济作物减产或绝收,烟草花叶病毒,水稻病毒病,花生病毒病：影响我国花生产量的重要病害。一般年份，病毒病引起减产5%-10%，大流行年份能减产20%-30% 小麦丛矮病：平均造成30%的产量损失 油菜病毒病：造成的产量损失常年达20-30%,自1986年Powel-Abel首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白（CP）基因导入烟草，培育出抗TMV植株以来，已经针对许多病毒成功的构建了多种抗病毒植株，如抗番茄花叶病毒（TOMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、苜蓿花叶病毒（ALMV）、黄瓜花叶病毒（CNV）、水稻条纹病毒（RSV）等抗性植株。,（三）抗细菌和真菌作物,将“抗菌肽”基因导入植物 将“溶菌酶”基因导入植物,（四）抗除草剂转基因作物,除草剂的作用机制是破坏氨基酸的合成途径和破坏植物光合电子传递链蛋白质的功能。通过改变除草剂靶酶的水平、修改靶酶的敏感性和解除除草剂毒性酶基因，将解除除草剂的编码蛋白基因导入宿主植物，使宿主植物免受伤害。,（五）抗非生物胁迫作物,1.抗旱 2.抗寒 3.抗盐 4.抗氧化 5.抗早熟,(六）其他转基因农作物,黃金米(Golden Rice)：一种转基因大米品种,含有可合成胡萝卜素的基因,可合成維生素A 的前体物，可缓解发展中国家维生素A缺乏的问题。,莎弗西红柿（转基因延熟番茄）：将“延熟基因”转入西红柿，延长西红柿的的成熟期。,二、 生物反应器,转基因植物作为一种新型的生物反应器，可以生产过去只能从稀有植物乃至其它生物体才能获得的，或者收获量甚微的一些具有商业价值的物质。如激素、抗体、疫苗、营养蛋白、酶、生长因子、药物及保健品等。,三、 转基因植物的安全性,随着转基因技术的飞速发展以及转基因生物的大面积推广，在关注转基因生物所带来的巨大社会、经济和生态效益的同时，转基因生物及其产品的安全性问题也引起世界范围内的广泛关注。农业转基因生物及其产品对人类健康和生态环境是否会带来潜在不良影响，已引起人们的普遍关注。 在人类的科技发展史上，除了40年代中期发展起来的核技术外，恐怕没有像基因工程技术一样，在全世界引起如此大的关注和争议了。,（一）标记基因的安全性 （二）转基因植物的安全评价和争论的问题 1.环境安全 （1）生存竞争 （2）生殖隔离距离 （3）与近缘野生种的可交配性 （4）对非靶生物的影响 （5）病毒发生变异重组或异源包装的可能性 2.转基因植物食品安全性及对人健康的影响,转基因动物,利用基因工程技术将目的基因导入动物受精卵或早期胚胎内，使目的基因随细胞分裂而增殖并在体内表达，且稳定地遗传给后代的动物,加速动物育种 建立人类疾病模型 提供人体移植器官 研究基因表达调控 转基因动物作为生物反应器,一、动物转基因技术,关键技术 目的基因的获取 DNA重组目的基因与“载体”的连接 重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞 胚胎移植技术 转基因动物的鉴定,（一）显微注射法（microinjection),显 微 注 射 法 的 流 程,（二）逆转录病毒法,逆转录病毒的生活周期,逆 转 录 病 毒 法 的 流 程,卵裂和胚泡的形成,（三）胚胎干细胞法,胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞）全能性 ES细胞在解除分化抑制的条件下，具有（生殖腺等）各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力,胚 胎 干 细 胞 法 的 流 程,（四）精子载体法,精 子 载 体 法 的 流 程,（五）体细胞核移植法,Dolly,二、转基因动物的应用,动物育种中的应用 提高动物的抗病能力 提高动物生长速度 提高动物产毛性能 改善乳品品质 在基因功能等生命科学基础研究中的应用 基因敲除技术（knock-out),医药科学研究中的应用 药理学中的应用 人类疾病模型,动物生物反应器（从转基因动物体液或血液中收获基因产物） 原理：将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内以制备转基因动物，并使外源基因在动物体内（乳汁、血液等）高效表达，然后再分离提取目的基因编码产物 乳腺生物反应器（mammary bioreactor),动物药厂 通过转基因动物生产感兴趣的基因 把YFG放在乳球蛋白的启动子下 注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内 YFG在乳腺中表达 乳汁中提纯YFG蛋白。,产品名称 治疗功能与医药范围 人胰岛素 治疗糖尿病 人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合 干扰素 治疗癌症、病毒感染 干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 干扰素 治疗癌症、病毒感染 人组织纤溶酶原激活因子(tPA) 溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 红细胞生成素 (Epo) 治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 凝血因子 治疗A型血友病 神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化,蛋白质和多肽类活性物质,基因治疗,疾病基因的发现 1990年美国科学家首先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成 2001年2月12日由科学和自然杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因 揭示人类4万个基因功能的任务非常艰巨 已知人类遗传性疾病约有3000种,一、基因治疗的概念,改变人遗传物质为基础的生物医学治疗 通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法,疾病的根源异常的基因,基因治疗概念的扩展凡是采用分子生物学技术和原理，在核酸水平上展开的对疾病的治疗,二、基因治疗的策略,基因置换：用正确的基因原位置换错误的基因最理想的策略 基因修复 基因修饰（基因增补）：不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，弥补基因的功能最主要的策略 基因失活 免疫调节,三、基因治疗中治疗基因导入病人体内的方式,直接体内疗法:治疗基因体内靶细胞 间接体内疗法:从体内取出靶细胞导入治疗基因筛选扩增回输体内,治疗基因的导入方式,四、基因治疗的基本程序,治疗性基因的选择 基因载体的选择：病毒载体，非病毒载体 靶细胞的选择：体细胞（干细胞），生殖细胞（X） 基因转移：间接体内疗法，直接体内疗法 外源基因表达的筛选,（一）治疗性基因的选择 单基因（疾病） 多基因（疾病）：心血管疾病、代谢性疾病 恶性肿瘤：原癌基因，抑癌基因 病毒性疾病,基因治疗的范围,（二）基因载体的选择 病毒载体系统(70%) 定向感染性、寄生性 剔除致病基因和复制相关基因 逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒 非病毒载体系统(30%) 效率低，安全性高,腺 病 毒 作 为 载 体 导 入 治 疗 基 因,（三）靶细胞的选择 体细胞:造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞 生殖细胞（X),四、基因治疗的临床应用,（一）遗传病的基因治疗 血友病：人凝血因子 地中海贫血:珠蛋白,（二）肿瘤的基因治疗 针对癌基因的治疗 针对抑癌基因的基因治疗：P53 针对免疫系统的基因治疗,（三）代谢性遗传病 ADA与严重联合免疫缺陷综合症 （四）心脑血管病的基因治疗 血管内皮生长因子VEGF,（五）病毒性疾病的基因治疗,RNA干扰,HIV感染的基因治疗 病毒性肝炎的基因治疗,HIV的基因治疗RNA干扰,