2015-2016学年人教版选修一-微生物的分离、培养和菌种保藏幻灯片(51张)

微生物的分离、培养和菌种保藏,微生物的分离、培养和菌种保藏,目的要求 实验材料 试验程序 思考题,目的要求,初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏的基本方法。 练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。,实验材料,样品：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏1号培养基。 无菌水：装有50mL无菌水三角瓶（配土壤悬液使用）、装有250mL无菌水三角瓶（梯度稀释使用）、4支空的无菌试管。 其它：取液器(5000 l, 1000 l, 各一支);无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴、水浴锅。,实 验 程 序,微生物的分离 微生物的接种方法（示范） 微生物培养中的氧气条件 微生物的菌种保藏方法 四大类微生物菌落形态的比较和识别,实验程序1 （微生物的分离）,用平板涂抹法分离土壤中的放线菌 用平板划线法分离污水中的细菌,微生物的分离稀释平板法,制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤0.5g，放入50mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释102的土壤悬液。 2. 另取装有4.5mL无菌水试管4支，用记号笔编上103、104、105、106。取已稀释成102的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取0.5mL土壤悬液加入103的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成103土壤稀释液。同法依次连续稀释至104 、105、106土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图-1。,图1 土壤稀释液的制备和稀释液的取样,微生物的分离平板涂抹法,每组取无菌培养皿2付。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 凝固后，另取一支吸管吸取103或104的土壤稀释液0.2mL放在平板上。 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于2830条件下培养67d，观察放线菌菌落形态及计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量（方法同上）。 挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止。,微生物的分离平板划线法,每组取无菌培养皿1付，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。 凝固后，用接种环取相应的 菌液一环（105或106）在平板上划线（教师作示范）。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28300C温室培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28300C温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。,高氏培养基用于涂布平板（梯度稀释法取0.2ml，用推棒推匀）（浅色培养基） 牛肉膏培养基用于划线分离（分离所使用的污水在试管架的试管中）,实验程序2 （微生物的接种方法斜面接种法）,左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌种试管，内侧是待接的空白斜面。（两支试管的斜面同时向上），右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。 将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却，而后再用环沾取一定量的菌苔，将沾有菌苔的接种环抽出试管。,迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部，轻轻向上划线（直线或曲线）。 接好种的斜面试管口再次过火焰，棉塞底部过火焰后立即塞入试管内。 将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼，使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，使菌体爆溅，造成污染。 放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口23cm处贴上标签。 2837 恒温培养。,无菌操作简介,微生物的接种方法液体接种和穿刺接种,液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。 穿刺接种法：用接种针经火焰灭菌后，沾取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后沿着原接种线将针拔出，要做到手稳、动作轻巧迅速，最后塞上棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。,实验程序3 （微生物培养中的氧气条件）,参观培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵摇床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。厌氧培养罐（图9），以某种气体取代培养容器中空气，并添加还原剂，如产气袋法和换气法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖美兰指示剂。,微生物培养中的氧气条件厌氧培养,美兰氧化还原指示剂：0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。,微生物培养中的氧气条件厌氧培养,微生物培养中的氧气条件厌氧培养,生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。 化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。 物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。,实验程序4 （微生物的菌种保藏方法）,菌种保藏是微生物学工作中的重要一环，微生物菌种保藏的目的要求达到以下三点： 1.保持原种性状,延缓或防止退化。 2.保持活力而不死。 3.保证纯培养，防止污染。 微生物菌种保藏的关键是使微生物代谢作用缓慢，处于休眠状态。为此，要求降低其体内酶的活性。一般采用低温、干燥和缺氧条件来实现。 菌种保藏的方法有: 冰箱斜面保藏、石蜡封藏法、砂土管保藏法、冷冻低温干燥法和液氮保藏法等。,微生物的菌种保藏方法,斜面冰箱保藏法：将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入4 冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。 缺点：移接代数太多，易产生变异、退化。 石蜡封藏法：在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。 石蜡的处理：250mL三角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min，然后放在105 左右的烘箱中1h，使水分蒸发掉。,砂土管保藏法：(可用于保藏产孢子的放线菌、霉菌和产芽孢的细菌）。 1.砂土管的制备：取河沙若干，用40目过筛，出去大颗粒，加10%HCl后煮沸30min，除去有机质（也可用10%HCl浸泡24h)。最后倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取0.3m以下非耕作层的瘦黄土若干，晒干磨细，过120目筛。 2.按 土：砂1：4 的比例均匀混合，装入指形管中，以1cm高为宜，塞上棉塞，160170干热灭菌2h。 3.在新鲜菌种斜面上加入3mL左右的无菌水，用无菌接种环制成菌悬液，用无菌吸管吸取0.20.3ml的菌悬液放入每个砂土管中，用接种环拌匀，并贴上标签，注明菌名。 4.菌液加好后，立即进行抽真空干燥，要求在24h内抽干，尤其是夏天要求较短时间内抽干。摇散砂土，放干燥器内冰箱保藏。,冷冻真空干燥保藏法：此法一般常用于细菌或病毒一类的菌种保藏，常用脱脂牛奶或血清作为菌种的保护剂。 1. 脱脂牛奶的制法：将牛奶加热到80左右，然后冷却，除去表面的一层脂肪。这样反复23次后用脱脂棉花过滤，并在3000r/min的离心15min，再除去表面脂肪。将脱脂牛奶装入三角瓶中，用0.5kg/cm2高压灭菌30min，连续2次，并作无菌试验。 2. 用无菌的脱脂牛奶将新鲜斜面菌种制成牛奶菌种悬液，无菌操作装入安瓿管中（装量不超过其体积的1/3)。 3. 预冻：将分装好的安瓿管在2540 之间的干冰酒精中进行预冻，1h后即可抽气进行真空干燥。 4.真空干燥：预冻后放入真空干燥箱中，开启真空泵进行干燥。 5.封管前将安瓿管装入多歧管上，开启真空泵，当真空度达到0.01mm汞柱后用火焰熔封。 6.做好的安瓿管放入冰箱中保藏。,实验程序5 （四大类微生物菌落形态的比较和识别）,区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面的观察。 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌薄而小，酵母菌厚而大。 菌落表面干燥：放线菌密而小，霉菌松而大。 气味 细胞形态： 细菌小而分散 酵母菌大而分散 放线菌丝状细 霉菌丝状粗,四大类微生物菌落形态的比较和识别,思 考 题,什么叫无菌操作？ 平板培养时为什么要把培养皿倒置？ 好氧培养和厌氧培养的原理和方法有何异同？ 试述菌种斜面冰箱保藏、石蜡封藏和砂土管保藏等方法的原理。,试验报告,平板涂布法 划线分离法原理操作 微生物菌落特点，描述一个菌落 菌种保藏的要求，及菌种保藏的主要方法,实 验,结 束,实验八,细菌鉴定中常用的 生理生化反应,实验目的和内容,a. 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法； b. 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合