微生物的实验室培养幻灯片

,老师的几点希望,1、按时出勤，不要人间仙界来回穿梭，更不要四海八荒到处溜达 2、上课要带着元神来，不要只有仙体在 3、老师会把十几年的修为毫无保留滴渡给你，帮你渡劫 4、自己要努力，争取顺利飞升上神，最起码也要上仙，千万不要应劫、挂科 5、学好这门课，收益三生三世，收获十里桃林,到目前为止， 几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关,课题1 微生物的实验室培养,专题2 :微生物的培养与应用,获得纯净培养物的要领：,为需要培养的微生物提供合适的生存条件（即营养和环境条件） 阻止和抑制其它微生物的生长,一、基础知识：,（一）生存条件培养基,培养基（培养液）是按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,（1）按物理状态来分：培养基可分为液体培养基和固体培养基（是否添加凝固剂：琼脂） （2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。 （3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型和用途,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,back,半固体培养基：,(是否运动),无动力,有动力(弥散),固体培养基：菌落,微生物需要的五大类营养要素物质是：,微生物需要的营养物质及功能,1.碳源 2.氮源 3.水 4.无机盐 5.生长因子（非必需）,：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。,无机碳源：CO2；NaHCO3等,有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等,构成细胞物质和一些代谢产物 异养微生物的能源,.概念,.来源：,.作用：,1.微生物的碳源,2、培养基的营养构成,自养生物,异养生物,无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。,有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。,主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。,2.微生物的氮源,.概念：,.来源：,.作用：,3.生长因子,.常见的生长因子：,.概念：,.作用：,微生物生长不可缺少的微量有机物。,酶和核酸的组成成分。,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,碳源、氮源、生长因子的比较,思考：,下表是对四种生物的能源、碳源、氮源、新陈代谢类型的描述，正确的一组是（ ）,葡萄糖,NH4+,异养需氧型,B,葡萄糖,3、培养基配制原则：,（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。 （2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。 （3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。 细菌pH为：6.5-7.5； 放线菌pH为：7.5-8.5； 真菌pH为：5.0-6.0。,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,消毒定义： 利用较温和的物理或化学方法，杀死部份微生物的过程。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,灭菌的定义：,使用强烈的理化因素消灭所有微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌。 二者的作用原理一致：使蛋白质变性来抑制微生物生命活动或者杀死微生物,防止外来杂菌的入侵,（二）无菌技术,煮沸消毒法：100煮沸5-6min 巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min 化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源 紫外线消毒：照射30min,.消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,灼烧灭菌 干热灭菌：160-170 下加热1-2h。 高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,.灭菌的方法：,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,二、实验操作（以培养大肠杆菌为例）,大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。主要生活在大肠内。,属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。,大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。,培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。,由于具有体积小、结构简单、易培养、生活周期短、变异类型容易选择等优点，常做为遗传学研究的实验材料。,.制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算 2.称量 3.溶化 4.灭菌: 将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。 5.倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。,二、实验操作（以培养大肠杆菌为例）,倒平板操作,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，又可以避免培养基表面的水分地挥发。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,.纯化大肠杆菌,平板划线法和稀释涂布平板法。,微生物的接种的常用接种方法有：,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,菌落是鉴定菌种的重要依据,菌落,细菌的菌落特征因种而异,细菌的菌落比较小，大多数表面光滑粘稠,霉菌的菌落特征 因种而异,菌落,霉菌的菌落常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有的表面还能呈现红、褐、绿、黑、黄等不同孢子的颜色,.纯化大肠杆菌,平板划线法和稀释涂布平板法。,微生物的接种的常用接种方法有：,1.平板划线的操作方法,平板划线的操作,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落； 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：线条末端细菌的数目较少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板的操作方法,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,4.菌种的保存,接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。,3.微生物的恒温培养,.长期保存：,甘油冷冻管藏法,.临时保藏：,3.微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌 2、培养基的配制 3、培养基的灭菌 4、倒平板 5、微生物接种 6、恒温箱中培养 7、菌种的保存,三.结果分析与评价,.培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 .接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 .是否进行了及时细致的观察与记录 培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 （二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 （三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,本课题知识小结:,【典例解析】,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是 A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,答案：D,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,答案：B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是A正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答： （1）右表培养基可培养的微生物类型 是 。 （2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。 如不想浪费此培养基，可