临床血液学检验技术实验六血红蛋白电泳、异丙醇和抗人球

1、血红蛋白电泳（每组4份） 2、异丙醇沉淀试验（每实验室1份） 3、红细胞包涵体试验（每实验室1份） 4、抗人球蛋白试验（每组1份）,实验六,1、血红蛋白电泳 Hemoglobin Electrophoresis,原理,pH8.6,血红蛋白的等电点小于缓冲液的pH值时，血红蛋白带负电，在电场中，从负极向正极泳动,由于不同血红蛋白所带电荷不同，分子量不同，其泳动的速度不同，可以分离出各自的区带,操作,血红蛋白液的制备 浸膜 pH8.5TEB缓冲液中浸透，用滤纸吸干 点样：用加样器在膜的粗糙面加Hb液，区分毛面，光面 电泳：点样线在负极一侧，毛面向下，平衡10min后接电源，调节电压至210V，电泳1520min 染色：丽春红S染色，用3%醋酸液漂洗至底板显白色后自然干燥,结果观察,注意事项,醋纤膜在加样前应把水分吸干，否则影响区带分离的清晰度。 电泳时间不宜太长，应灵活掌握。以HbA和HbA2两区带分离清晰为电泳终止的时间。 电流不易过大，否则会导致区带过于集中，达不到分离效果。 正常对照和已知异常Hb对照（质控）。,临床意义,与正常比较，发现异常血红蛋白区带。如HbH, HbE, Hb Barts, HbS, HbD, HbC等。 HbA2增多见于-地贫，轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。HbE病也在HbA2区带位置增加，但含量很大（10%）。,琼脂糖凝胶电泳,毛细管电泳,2、异丙醇沉淀试验,异丙醇为非极性溶剂，可降低Hb分子内部氢键 不稳定Hb稳定性下降，在异丙醇中更快沉淀,操作步骤,取17%的异丙醇液1ml加入试管中37预温10分钟 加入0.1ml的Hb液，混匀，计时 37水浴 5min，10min，15min，20min， 30min分别观察 5min出现浑浊， 20min出现大块沉淀则为强阳性。,每班四位同学，两位分别做一份标本，另两位同学陪同，手机拍下每一时间点结果。该结果在教师电脑上打开给同学介绍。,注意事项,异丙醇浓度及温度应严格控制，pH値不得低于7.2，预热温度不足可致假阳性。 Hb浓度应控制在10%，过低会形成假阴性。 Hb液需要新鲜配制，久置可导致假阳性。 HbF含量过高可产生假阳性。,临床应用,U-Hb（不稳定血红蛋白）阳性， HbF,HbH, HbE增多、地贫、G-6PD缺陷可出现阳性 早产儿脐带血阳性 + 脐带血阳性 + 新生儿阳性 + 1 - 3月 (+)(-) 4 - 6月 (-)(+) 6月-成人 (-),3、抗人球蛋白试验 Coombs Test,Coombs Test,操作步骤,1ml抗凝血于试管中，3000rpm/min，弃去血浆层 等量生理盐水洗涤红细胞，3000rpm/min，弃去上清，重复3次，第三次完全弃去生理盐水 用生理盐水配制3%-5%的红细胞悬液 测定管加两滴coombs试剂，对照管加两滴生理盐水，然后再分别滴加2滴红细胞悬液 1000rpm/min离心5min后，镜检看有无凝集,4、红细胞包涵体试验,取干净试管加入全血1滴。 再加入包涵体染液2滴。 静置一个小时后，推片镜检。 镜下数1000个红细胞中，含有包涵体的红细胞的个数，计数百分比。,红细胞包涵体试验,作业,血红蛋白电泳（正常血红蛋白电泳图与临床意义） 异丙醇实验原理、临床意义 抗人球蛋白实验原理、临床意义 你的实验结果与评价。,PBL第一幕安排,分发PBL第一幕资料 实验分组，A组分8个小组。 同学们课外组织讨论，于下周一，将你们准备在PBL课堂上要讨论的问题、名单、组长、秘书发至：XX163.com. 我会尽快回复你们的问题（最迟周二晚） PBL讨论当天安排（PPT介绍实验内容、1-4组同学PBL、5-8组同学看细胞。40分钟后交换内容。）,制备血红蛋白液：,109mmol/L枸橼酸盐抗凝血1ml置于5ml离心管内3000r/min离心10分钟，弃血浆和白细胞层。 以8倍RBC体积的生理盐水洗涤RBC3次，每次3000r/min离心10分钟，最后一次3000r/min离心15分钟，弃上清。 压积RBC中沿管壁加入两倍蒸馏水，弃上清，重复2次 压积RBC中沿管壁加入等量蒸馏水，置于振荡器上震荡5分钟，使完全溶血，随后加入RBC压积1/2量四氯化碳，置于振荡器上震荡5分钟。 3500r/min离心20分钟分离上层血红蛋白液。,