临床血液学检验技术血液病MICM检验

血液病MICM检验,医院血液内科,背景介绍,血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，以贫血、出血、发热为特征的疾病。,出血性疾病,贫血症,白细胞疾病,常见血液病,造血系统恶性肿瘤,FAB分型 1976,MIC分型 1986,MICM分型 2001,MICM分型 2008,白血病的诊断分型：MICM分型发展由来,MICM分 型 2016,1827年， 法国的Alfred Velpeau 描述第一例白血病 1847 年，Virchow首次提出了“白血病”这个名称 1976年，法、美、英3国7位血液学家以光镜下的形态为主，参照细胞化学染色，制定了FAB分型标准，标志着现代白血病诊断与分型的开端 80年代末至90年代初，随着免疫学、细胞遗传学和分子生物学理论和技术的发展，出现了MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学）分型 WHO造血和淋巴组织肿瘤分类方案（2001， 2008、2016）,FAB分型及WHO分类,FAB：主要建立在形态学基础上 WHO (2001和2008、2016) 骨髓或外周血原始细胞比例20% 将一些有明确诊断及预后指导意义的细胞或分子遗传学异常作为诊断和分型的重要标志 将患者诊断之前的疾病状态和治疗措施纳入考量,FAB和WHO分类方案的主要区别,急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 WHO分型,伴再现性遗传学异常的AML 伴MDS相关改变的AML 继发于MDS或MDS/MPN 伴有MDS相关细胞遗传学异常 2或3系50%以上的细胞有发育异常 治疗相关性AML 不另作分类的AML 髓细胞肉瘤 Downs综合征相关髓系增生疾病 母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤,伴再现性遗传学异常的AML,AML with t(8;21)(q22;q22) RUNX1-RUNX1T1 AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16) CBFB-MYH11 APL with t(15;17)(q22;q12) PML-RARA AML with t(9;11)(p22;q23) MLLT3-MLL AML with t(6;9)(p23;q34) DEK-NUP214 AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3) RPN1-EVI1 AML -M7 with t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1 ? AML with mutated NPM1 ? AML with mutated CEBPA,通常AML的诊断标准，原始细胞比例20%，但如果t(8;21)、t(15;17)或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，AML诊断成立,MICM FAB形态学诊断(Morphology) 免疫学检查(Immunology ) 细胞遗传学检查(Cytogenetics) 分子遗传学检查(Molecular),MICM分型原则中各检测技术简介,形态学：外周血涂片、骨髓涂片±骨髓活检 免疫表型检测：多参数流式细胞仪 细胞遗传学检测 常规核型分析，分子核型分析 FISH 分子遗传学检测 融合基因检测（RT-PCR）：PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11、MLL-、BCR-ABL 基因突变：FLT3-ITD、CEBPA、NPM1、TET2、IDH1、NOTCH1、IKZF1、FBXW7 拷贝数变化（CNV）:SNP-array 高通量测序技术,病史 形态学： 结构：活检 细胞学：涂片 骨髓血凝块 免疫分型： 流式细胞或免疫组化 细胞遗传学：核型分析、FISH 分子遗传学：融合基因（RT-PCRQ-PCR)/基因突变（测序）,白血病MICM诊断程序及技术,白血病诊断的任务不仅仅是FAB分类,是不是白血病？ 急性？慢性？ 系来源 FAB分类 预后分层 治疗、疗效判断 MRD,病史+形态,形态+免疫,形态+免疫+遗传+分子,形态+免疫+遗传+分子,为什么需要MICM综合诊断？,形态或病理或加细胞化学分析受观察者个体经验及分辨力的限制，一致率仅50-70%； 在此基础上增加免疫组化和/或FCM分析大大增加了分型的准确率，可达90%以上； 染色体、FISH及基因分析，进一步提高分型的准确率,MICM整合诊断的临床意义,全面正确诊断与分型 评估预后 确立检测MRD的标志，追踪MRD 帮助建立分层、个性化的治疗 定期追踪帮助发现抗原丢失、克隆演变或突变 帮助确定病因或发病机制,MICM分型原则中各检测技术简介,细胞形态及细胞化学分析的优缺点,优点： 直观：镜下直接观察细胞形态，对MDS的诊断、一些少见的、大的恶性细胞的确定优于流式细胞分析恶性细胞的比例更准确： 简单快速，有显微镜即可完成报告 缺点： 人为因素影响大 难以鉴别细胞的成熟阶段，B、T等系列的恶性细胞 细胞较成熟时，难以鉴别良恶性 不能提供太多的预后信息,形态M,病理及免疫组织化学的优缺点,标本直接固定，不容易损失信息，恶性细胞比例更客观，对一些抽不出或少见细胞，仍可诊断。如伴骨髓纤维化、MM、淋巴瘤、转移癌、组织细胞、巨噬细胞、树突细胞、何杰金细胞等 可以直接观察到组织结构，容易确定恶性细胞的组织部位 诊断慢、受诊断者个人经验及知识水平影响大 对一些组织结构无破坏、细胞形态改变不大的细胞，难以鉴定良恶性及成熟度 有些恶性细胞在液体中，难以获取组织标本，难以判断组织结构,形态M,流式细胞术,流式I,FCM检测的参数,FSC: 细胞大小 SSC:细胞内颗粒多少及细胞内构造的复杂性 FL：3-10多种（荧光素耦联的单克隆抗体）,流式I,R8：幼稚细胞群，正常骨髓中此群细胞数量极低或空缺,流式I,确定系来源 原理：不同系有特定的抗原表达 髓系/B系/T/NK系/组织细胞和树突状细胞 确定细胞分化阶段 不同发育阶段细胞，其抗原表达不同 预后判断 有些抗原表达和淋巴瘤/白血病预后相关 治疗方法选择-治疗靶向 疗效判断、复发监测 诊断双表型、混合性，M0、未分化型等特殊类型白血病 髓系分亚型与FAB分亚型有一定差异,1）血液系统肿瘤的免疫表型分析,流式细胞免疫分型的作用,I： immunology,免疫学,M0 CD34,CD33,CD13 M1 MPO,CD34,CD33,CD13, HLA-DR M2 MPO,CD34,CD15,CD13, HLA-DR M3 MPO, CD33,CD13、CD9(HLA-DR、CD11b常阴性) M4 MPO,CD33,CD15,CD14,CD13 M5 CD68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36，CD64 M6 CD33,CD235a,CD71 M7 CD33,CD41,CD42b,CD61,急性髓系白血病免疫表型与FAB分型相关性,形态与免疫表型的符合性不足80%，不能脱离形态学单纯依赖免疫表型进行白血病的诊断与分型。FAB基于形态，两者不符以形态为主。,流式I,混合性白血病的判定,如有2 系或以上的特异性标志，可诊断为急性混合性白血病,流式I,MRD流式细胞学检测,肿瘤细胞与正常起源细胞免疫表型不同 跨系表达 抗原表达不同步 抗原表达丢失 抗原表达减弱 其它抗原表达 初始免疫分型结果、白血病相关表型特点 抗体组合越多覆盖率越高、敏感性越高 假阳性、假阴性均存在 随访、动态观察更有意义,流式I,监测外周血造血干细胞的动员效果 指导外周血造血干细胞的采集时机 判断造血干细胞采集量 3）红细胞分析 网织红细胞计数 血细胞CD55和CD59表达水平分析 红细胞内HbF的分析 红细胞表面相关免疫球蛋白测定,2）造血干/祖细胞计数（CD34+细胞的测量）,流式细胞免疫分型的作用,流式细胞免疫分型的作用,4）血小板分析 循环血小板活化分析 血小板对体外不同刺激剂的反应性测定 血小板免疫表型分析 血小板自身抗体测定 血小板免疫计数 网织血小板计数 抗血小板药物治疗监测 5）外周血淋巴细胞亚群计数 监测肿瘤患者的病情 监测机体的免疫状态 监测病毒感染等等,FCM的优缺点,优点： 一次可检测数万至数十万个细胞上的数十种标记，可同时检测每个细胞的六个以上参数，敏感性高，分析全面 更容易区分良恶性，恶性细胞的系列及成熟度 可帮助确定免疫治疗的靶点并监测疗效，如CD20、CD19是监测MRD覆盖面最广的方法。 快速、简便、重复性好 缺点： 不能确定组织结构，一些罕见的大细胞不能分析到，一些细胞粘附性高，难以抽出。因此对HL等难以确诊。 判断恶性细胞的比例不如形态准确，对M6、MDS的诊断不如形态 预后价值不如染色体和基因的检测,流式I,诊断误区举例,原始细胞增多是诊断前体恶性血液病尤其AL的重要指 标，但原始细胞应根据免疫学标志/基因/染色体证实 为恶性造血前体细胞 一些形态上的原始细胞可以是正常造血细胞（尤其见于儿童感染后，G-CSF,GM-CSF等刺激或化疗后或移植后）,病例1 儿童B-ALL,化疗3年后停药，来我院复查，骨髓涂片8%的幼稚细胞,流式幼稚B淋巴细胞增生，未见异常表型,病例2 NK细胞白血病移植后40天，骨髓涂片8%的幼稚细胞,流式: 未见表型异常细胞，CD34阳性细胞为幼稚B淋巴细胞,即染色体异常 包括染色体的结构和数量异常 根据这些特征性的异常，对恶性血液病进行诊断和分类、预后分层及指导治疗。,细胞遗传学C,血液染色体检验,1950,1960,1970,1980,1990,2000,2010,确定染色体数目=46,发现Ph； 发现+21,各种显带技术出现；发现多数AL患者伴有染色体异常,FISH出现；阐明某些染色体异常的分子学改变,SKY CGH PCR技术 FLT3-ITD(1996) c-KIT突变（1993） ,芯片技术：cDNA array、SNP-array、 测序技术的发展 大量基因突变的发现：JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1,新一代高通量测序技术；各种遗传学改变间的相互作用,白血病遗传学研究的历史,细胞遗传学C,细胞遗传学C,多数AML患者有非随机性染色体改变，包括易位、倒位、插入、缺失、扩增、等臂染色体等 染色体异常在AML诊断、分型、预后评价、发病机制研究及靶向治疗药物研发方面有重要价值 一些特殊的细胞遗传学异常在WHO分型建议中已被列为特殊亚型 对不同细胞遗传学类型的血液肿瘤患者进行个体化治疗可以获得更好的疗效,AML的WHO分型,伴再现性遗传学异常的AML 伴多系发育异常的AML 继发于MDS；无MDS病史,治疗相关性AML,烷化剂相关；拓扑异构酶抑制剂相关；其它,无法分类的AML 髓细胞肉瘤,Downs综合征相关AML,细胞遗传学C,伴再现性遗传学异常的AML,AML with t(8;21)(q22;q22) AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16) APL with t(15;17)(q22;q12) AML with t(9;11)(p22;q23) AML with t(6;9)(p23;q34) AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3) AML -M7 with t(1;22)(p13;q13),RUNX1-RUNX1T1 CBFB-MYH11 PML-RARA MLLT3-MLL DEK-NUP214 RPN1-EVI1 RBM15-MKL1,? AML with mutated NPM1 ? AML with mutated CEBPA 通常AML的诊断标准，原始细胞比例为20%，但如果t(8;21)、t(15;17) 或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，白血病诊断成立,细胞遗传学C,细胞遗传学C染色体核型分析 正常核型： 男：46，