分子诊断学第五章核酸扩增技术
第五章 核酸扩增技术,核酸扩增技术,Thermocycling based PCR (Polymerase Chain Reaction, Roche Diagnostics) Reverse Transcription-PCR (“RT-PCR“) Real-Time PCR Multiplex PCR Nested PCR On-Array-PCR Digital PCR LCR (Ligase Chain Reaction, Abbott Laboratories) -MLPA (Multiplex Ligation-dependent probe amplification) Isothermal techniques NASBA (Nucleic Acid Squence Based Amplification RCA (Rolling Circle Amplification) RPA (Recombinase Polymerase Amplification) SDA (Strand Displacement Amplification) LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) Signal Amplification bDNA (Branched DNA, BayerSiemens),第一节 聚合酶链反应,一、PCR的基本原理和反应过程 变性 Denaturing 退火 Annealing 延伸 Extension,Polymerase Chain Reaction (PCR),Example thermal cycler protocol Step 1 5 min at 94C Initial Denature Step 2 40 cycles of: 30 sec at 94C Denature 30 sec at 52C Anneal 1 min at 72C Extension Step 3 5 min at 72C Final Extension Step 4 Infinite hold at 4C Storage,二、PCR的反应体系和反应条件,（一）反应体系: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液 1. 模板（Template) 基因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA 模板DNA必须有较高的纯度 RNA作为模板，须先将RNA逆转为cDNA 常规PCR的模板DNA量一般仅需50-100ng左右 体系中较低量的模板有利于提高扩增的产量和减少 非特异性扩增。,（一）反应体系: 2.引物（Primer) 设计原则： 设在被扩增目的片段的双侧两端，并分别与模板正负链碱基序列互补。 长度以15至30个核苷酸为宜。 两条引物之间（尤其3-OH未端）的序列不能互补。 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。C+G 比例以45%-55%。引物3端尤其要避免重复的CG碱基序列。 PCR扩增的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，两条引物的Tm值不能差别太大。 据需要可在5端加修饰成分或标记分子。 保证与其它靶序列无同源性；引物浓度一般为0.1-1µM之间。,（一）反应体系: 3.Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase) 水栖噬热菌（thermus aquaticus)中提取，热稳定性高。 以DNA为模板，在引物3-OH端加上dNTP，在两者间形成3-5 磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸。 Taq DNA 聚合酶缺乏35核酸外切酶活性。在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。 Pfu DNA聚合酶,Vent DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性，具有较高的保真性，可使碱基错配率降低。 50-100l 的PCR扩增体系一般需1-2.5U酶。,（一）反应体系: 4.脱氧核苷三磷酸（dNTP) dNTP 是dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP四种 脱氧核苷三磷酸的混合物。 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致。 dNTP浓度一般为20-200M。 降低dNTP的浓度可相应提高反应特异性。,（一）反应体系: 5.Mg2+浓度 Mg2+是Taq DNA polymerase 不可缺少的辅助因子，可稳定扩增体系，提高酶活性。 Mg2+浓度过低使酶活力降低，过高使酶催化非特异性扩增。 通过实验优化PCR扩增条件，寻找Mg2+最佳反应浓度。,（一）反应体系: 6.其他因素 酶缓冲液pH用1050mM Tris-HCl 调整至8.3 8.8。当温度上升至72，体系的pH约在7.2左右，使酶发挥最大酶促活性。 PCR缓冲液中KCl的浓度为50mM，缓冲液可加BSA、Tween 20、DTT等酶保护剂。 扩增富含CG碱基序列时，可加入DMSO至终浓度为1g/L，利于破坏模板的二级结构。也可用7-deaza-dGTP代替dGTP，避免二级结构的产生。,（二）反应条件与优化: 1.温度 变性：95-97 ，使模板和产物DNA双链完全打开 退火：保证PCR扩增特异性的前提，一般低于引物Tm 5 。过低易产生非特异性扩增，提高退火温度可提高扩增的特异性，但也会降低扩增的效率。 延伸：一般为72 特殊情况下，可将PCR设为两个步骤：变性和退火延伸（72 和 Tm 之间）。,（二）反应条件与优化 2.时间 第一次变性应给予足够的时间（95 5min),使模板彻底变性后进入循环。 退火时间主要取决于引物长度 延伸时间主要取决于扩增产物长度，一般1kb/min。 200-1000bp的扩增片段，循环中变性、退火和延伸三个步骤的持续时间一般均为30-60秒。,（二）反应条件与优化 3.循环次数 一般为20-40次 PCR扩增效率呈S型曲线型。 平台出现的迟早与模板的初始量有关，体系中模板的初始量越多，平台期出现越早。 引物二聚体、反应副产物、反应成分的消耗、引物和产物间的竟争均会影响平台效应。 理论上PCR扩增的产物拷贝数应是2n，但实际上要少得多。 在定量分析PCR产物时，注意设置合适的初适模板DNA的量和循环次数，确定线性反应的最佳条件，避免在“平台效应”期对产物进行定量。,（三）提高PCR扩增特异性的方法 1.热启动PCR 2.递减PCR（Touch-Down PCR,TD-PCR) 3.促进PCR添加剂和助溶剂,一、电泳 凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断有无预期大小的扩增产物及扩增的特异性。 （一）琼脂糖凝胶电泳 分离、纯化、鉴定DNA（100bp-60kb）的常用方法 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳,第二节 PCR产物分析,二、PCR-RFLP （Restriction fragment length polymorphism, RFLP）,由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在用限制性核酸内切酶消化后，经电泳分析产生不同长度或不同数量的片段。,GAATTC,CTTAAG,EcoR 限制性内切酶位点的变化,三、PCR-SSCP 单链构象多态性 （Single-strand conformation polymorphism, SSCP）,单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二级结构依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变性条件下的电泳迁移率的差异。 技术路线：PCR产物95C变性5分钟，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。,PCR-SSCP原理示意图,四、高温变性的熔点曲线分析,双链DNA分子能结合荧光染料，在复性时结合荧光最强，随温度上升时荧光量逐渐降低。当温度升至其熔点温度(Tm)时荧光量急剧下降而形成熔点曲线，其波峰所在的温度即代表被检DNA分子的Tm值,高分辨率熔点分析技术 （High resolution melting,HRM),温度升高幅度0.02-0.1，分辨率高。 使用饱和染料（如ResoLight,LcGreen),当双链DNA局部解链，游离下来的染料不会再重新结合到DNA分子上去，荧光强度的降低能更精确地反映DNA分子的解链情况，能准确分辨出单个碱基序列的变化。 已广泛应用于基因突变扫描、SNP的筛查、DNA甲基化的分析。,五、PCR产物的序列分析,对于目的基因靶片段的序列鉴定以及对致病基因检测时分析靶片段中点突变的具体位置和性质。 序列分析模板的制备主要有： 纯化后直接作为模板进行测序 克隆入载体后以此作为模板再测序,DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法),一代测序(Sanger法),一代测序(Sanger法),第三节 衍生的PCR技术,一、逆转录PCR（RT-PCR） 是以细胞内总RNA或mRNA为材料进行核酸扩增技术。总RNA或mRNA在逆转录酶的作用下生成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因片段。 RT-PCR主要用于cDNA克隆、合成cDNA探针、检测RNA病毒和分析基因表达。 逆转录合成cDNA的方法有：特异性下游引物(GSP)、oligo (dT) 、random hexanucleotides,（一）RT-PCR体系 1.模板 2.引物 （1）随机引物 （2）Oligo dT （3）基因特异性引物 3.逆转录酶 （二）一步法RT-PCR和两步法RT-PCR,实时荧光定量PCR（real-time fluorenscence quantitative PCR)是指在 扩增周期每个时间点（通常是每个循环结束后），通过检测荧光强度对PCR过程中产物量进行实时监测，并根据标准曲线算出PCR的初始模板量。,二、实时荧光定量PCR（RFQ-PCR）,（一）荧光定量PCR的化学原理,嵌入型荧光染料： 特异性荧光探针： 基于荧光共振能量转移（Fluorenscence quantitative PCR,FQ-PCR)原理的技术： 1.水解探针（Hydrolization probe) 2.杂交探针（Hybridization probe) 3.分子信标（Molecular beacon),（一） DNA交联荧光染料技术,DENATURATION STEP: DNA + PRIMERS + DYE WEAK BACKGROUND FLUORESCENCE,ANEALING STEP:DYE BINDS dsDNA, EMITS LIGHT,EXTENSION STEP: MEASURE LIGHT EMMISSION,SYBR Green I染料,（二）特异性荧光探针,1.水解探针技术: TaqMan 5-3 Exonuclease,2.杂交探针技术（FRET 探针）,3.分子信标技术,1.基线：产物积累的荧光信号能被仪器检测到的最下限。 2.荧光阈值:一般以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。,（二）荧光定量PCR的重要概念,3.阈值循环数：Threshold cycle value，Ct值 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，也即Ct值的大小与样品中的模板的起始拷贝数成反比。 4.扩增曲线 5.标准曲线 6.熔解曲线,（二）荧光定量PCR的重要概念,（三）荧光定量PCR定量原理及结果分析,1.数学定量原理 起始模板的对数与Ct值呈线性关系 2.结果分析 （1）标准曲线法的绝对定量 （2）标准曲线法的相对定量 （3）比较Ct法的相对定量,（四）荧光定量PCR的特点,1.高特异性 2.高敏感性 3.可重复性 4.无污染,（五）影响荧光定量PCR的主要因素,1.引物-探针二聚体 2.引物和探针的浓度 3.Mg2+的浓度 4.循环数,三、多重P
