临床血液学检验技术第四章红细胞检验技术

第四章 红细胞检验技术 第五节 第八节,WHO? 金喜善 HA,地点：夜班急诊室医生工作站 砰的一声，门外护士急匆匆地领进来一家3口，患病的是小男孩，一岁半，面色惨白如纸，神情极度疲倦。没有哭闹，没有挣扎，连眼皮都不抬一下。家长告知孩子昨天发高烧，便自行跑到药房买退烧药给孩子吃。问吃了哪种药？正是尼美舒利。 立即给孩子氧，抽血送检验科加急检查，血红蛋白只有 22 g/L。孩子溶血，检验的难度增大。等待血型鉴定的时间显得格外漫长。检验科的血型检测出来A 型！ 输注 A 型洗涤红细胞悬液。孩子终于度过了重重难关。我们从死神手里抢回来了孩子的生命。,溶血一般检验 铁代谢检验 叶酸和维生素B12检验 红细胞膜缺陷的检测 红细胞酶缺陷的检验 免疫性溶血性贫血检验 血红蛋白异常的检验 阵发性睡眠性血红蛋白尿症检验,第五节 红细胞酶缺陷的检验,G6PD荧光斑点试验和活性测定 丙酮酸激酶荧光点试验和活性测定 高铁血红蛋白还原试验 变性珠蛋白小体生成试验 谷胱甘肽还原酶缺陷检测 G-6-PD基因检测,原理: G6PD 使NADP还原成NADPH, 后者在紫外线照射下发出荧光 （260365nm） ； NADPH在340nm处有一吸收峰，可通过单位时间生成的NADPH的量，计算G6PD活性。 参考值： 正常人强荧光； Chapman-Dern法酶活性2.8 7.3I U/gHb,一、G6PD荧光斑点试验和活性检测,G6PD荧光斑点试验和活性检测,荧光斑点适用于筛查; 活性测定对G6PD缺陷诊断有较高特异性和灵敏度 WHO推荐Zinkham法 新生儿血和网织红细胞酶活性较高 溶血发作期酶活性增高,二、高铁血红蛋白还原试验（MHb-RT）,原理： 亚铁Hb 高铁Hb RBC中的G6PD含量正常时，己糖旁路形成的NADPH作为MHb还原酶的辅酶，在递氢体-美蓝参与下，可使MHb还原为亚铁血红蛋白 G6PD缺乏，则MHb不能还原 本法仅作为过筛试验，其特异性和敏感性均不高， 条件时应直接测定G6PD活性。,亚硝酸盐,临床意义： =75%正常人 （脐带血=77 % ） 31%74% 中间反应型（杂合子） 30% G6PD显著缺陷（半合子或纯合子）,三、变性珠蛋白小体生成试验,又称 红细胞包涵体、Heinz小体、海因小体 原理：G-6PD缺乏致红细胞内GSH减少，高铁血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体，沉着红细胞膜上 本法仅能作为过筛试验,抗凝血+乙酰苯肼,37温育24h,充分氧化,Hb氧化成Heinz小体（结晶紫、甲紫或煌焦油兰）,1. 正常人 30% 2. G6PD缺陷症、不稳定Hb、HbH病等常高于45%,结果：小体为圆形或多角形色涵体，多位于红细胞边缘，以含5个以上小体的红细胞计数,第五节 红细胞酶缺陷的检验,G6PD荧光斑点试验和活性测定 丙酮酸激酶荧光点试验和活性测定 高铁血红蛋白还原试验 变性珠蛋白小体生成试验 谷胱甘肽还原酶缺陷检测 G-6-PD基因检测,铁指标的检验 叶酸和维生素B12的检验 溶血的检验 红细胞膜缺陷的检测 红细胞酶缺陷的检验 血红蛋白异常的检验 阵发性睡眠性血红蛋白尿症检验 免疫性溶血性贫血检验,第六节、免疫性溶血性贫血的检验,抗人球蛋白试验 冷凝集素试验 冷热溶血试验,一、抗人球蛋白试验,临床意义： 1）AIHA重要指标 直接试验（+） 间接试验（-） 2）其他：如冷凝集素综合征、药物诱发的免疫性溶血、PNH等直接试验（+） 3）新生儿同种AIHA Rh血型不合者直接、间接（+） ABO血型不合者（-）,二、冷凝集素试验,冷凝集素综合症患者血清中存在冷凝激素（IgM），在低温(0 4）时使自身红细胞、O型红细胞或受检者同型红细胞发生凝集，当温度上升(37）后凝集现象消失。,缗钱状分布红细胞,成熟红细胞随机呈块状或束状聚集，主要表现 1.多种抗体暴露； 2.HA（自身免疫性）； 3.非典型肺炎； 4.金葡菌感染； 5.冷凝集疾病。,三、冷热溶血试验,阵发性寒冷性血红蛋白尿征患者体内含有寒冷性溶血抗体(IgG)，在4条件下作用于自身红细胞后，即吸收补体造成溶血。将病人的血清置于冰箱中一些时间，再置于室温中，可出现溶血现象。这种先在低温时结合抗原并固定补体，在37时才表现溶血的抗体，又叫“双相抗体”（D-L抗体） 过筛试验,第六节、免疫性溶血性贫血的检验,抗人球蛋白试验 冷凝集素试验 冷热溶血试验,溶血一般检验 铁代谢检验 叶酸和维生素B12检验 红细胞膜缺陷的检测 红细胞酶缺陷的检验 免疫性溶血性贫血检验 血红蛋白异常的检验 阵发性睡眠性血红蛋白尿症检验,第七节 血红蛋白异常的检验,抗碱血红蛋白检测 HbF酸洗脱法检测 红细胞包涵体试验 异丙醇沉淀试验 血红蛋白电泳 PCR技术检测血红蛋白基因,一、抗碱血红蛋白检测,HbF抗碱变性的能力比HbA、HbA2强，在Hb液中加入定量的碱液后， HbA、HbA2即发生碱变性，可被半饱和硫酸铵沉淀，HbF因具有抗碱性仍留在溶液中，可用比色法测定其含量。 参考值：成人1 % 3.1% 新生儿55% 85%,临床意义： 1.HbF绝对增多： 珠蛋白生成障碍性贫血 重型3090%；中间型5 30%；轻型5% 持续性胎儿血红蛋白症HbF高至100%。 2. HbF相对增多：MP、AA、MM、PNH 3.孕妇和新生儿期HbF增加是生理性。 除HbF外，Hb Barts和部分HbH也具有抗碱能力，需通过电泳鉴别,二、红细胞包涵体试验,检测不稳定Hb过筛试验 不稳定Hb与1%煌焦油蓝共同孵育，红细胞内形成变性珠蛋白小体 参考值：正常人1% 温浴1小时出现的包涵体为HbH包涵体 U-Hb（不稳定血红蛋白）阳性， HbF， HbH, HbE增多，G-6PD缺陷可出现阳性,瑞特染色海因小体,新亚甲蓝染色海因小体,临床意义： 1.HbH包涵体：地中海贫血 2.不稳定血红蛋白病 3.红细胞葡萄糖六磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症，苯胺或硝基类化合物中毒，慢性肝病,三、异丙醇沉淀试验,不稳定Hb多由中性氨基酸互相替代或氨基酸缺失造成，多数并不引起Hb分子的电荷改变。 Hb液中加入非极性溶剂异丙醇后，可使Hb内的氢键结合减弱，正常Hb于37温育40分钟后可现沉淀，UHb只需5-20分钟即可。 血液中含有HbF、 HbH、 HbE、G-6PD缺乏、珠蛋白合成障碍性贫血可出现阳性。,注意: 17异丙醇液贮存时间不能太长，否则有假阳性。预热温度不足可致假阳性。 血红蛋白液必需新鲜久置可导致假阳性。 Hb浓度应控制在10%，过低会形成假阴性。 严格控制异丙醇浓度和反应温度 严格控制PH， pH値不得低于7.2，易致假阳性 HbF含量过高可产生假阳性,临床意义 不稳定Hb5分钟阳性，20分钟强阳性 HbE、HbF、HbH增高，G6PD缺乏症可出现阳性,四、血红蛋白电泳检测,各种Hb不同的肽链含有不同的氨基酸，因此具有不同的等电点，在一定pH值的缓冲液中可带不同的电荷。在碱性缓冲液中Hb带负电，反之带正电荷。 如果肽链中一个或几个氨基酸被取代或缺失后，有时所带的电荷也随之发生改变，在一定的电场中，其迁移速度因所带电荷的强弱而不同。,-,+,点样线,几种血红蛋白液的制备法比较,CCl4法：Hb液清晰、稳定，膜蛋白及CCl4在试管底部，易分离，但毒性大。 氯仿法 ：能沉淀不稳定的血红蛋白（UHb），不宜作Uhb检查，毒性较小。 皂素法：可使抗性较强的靶型红细胞完全溶解。 滤纸取血法：适宜外出取血和普查。 蒸馏水法：简便易行，未除去膜蛋白，且Hb液不能保存。,1.微量醋纤膜血红蛋白电泳,浸膜 点样 电泳 染色 透明 结果,正常人Hb电泳谱显4条区带，最近阳极端量最多的为HbA，其后为少量的HbA2。再后有两条更少的RBC内非Hb蛋白成分NHb1 和N Hb2（如不染色或用联苯胺染色则不出现）。 HbF在HbA之后，通常很难与HbA分离开。 + - 国内已发现的最常见和重要的异常Hb多可与HbA分离开。,HbA,HbA2,根据各Hb电泳的速度可分6组： H组（快速异常） HbH J组（快速异常） A组 HbA G组（慢速异常） D组（慢速异常） HbD E组（慢速异常） HbE、 HbA2,pH6.5电泳,HbH的等电点为pH5.6，为目前已知异常Hb等电点最低的一种，在pH6.5的环境仍可向阳极移动，而其他Hb均泳向阴极，借此可以鉴别。,起点 HbBarst,_ HbA2 HbA HbH +,注意:,醋纤膜在加样前应把水分吸干，否则影响区带分离的清晰度。 电泳时间不宜太长，应灵活掌握。以HbA和HbA2两区带分离清晰为电泳终止的时间。 电流不易过大，否则会导致区带过于集中，达不到分离效果。 正常对照和已知异常Hb对照。, ,+,-,液相,固相,电渗流,电渗示意图,临床意义:,与正常比较，发现异常血红蛋白区带。如HbH, HbE, Hb Barts, HbS, HbD, HbC等。 HbA2增多见于-地贫，轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。HbE病也在HbA2区带位置增加，但含量很大（10%）。,评价,筛选异常血红蛋白 不能分离的Hb应进一步做等电聚焦、HPLC、基因检测等,2.琼脂糖凝胶电泳,地中海贫血(HbH病) 病人资料 姚某，女，13天 碱性血红蛋白电泳: HbH： 57% HbA+F： 42.5% HbA2： 0.5%,地中海贫血（重型） 病人资料 黄某，男，1岁3个月 碱性血红蛋白电泳: HbA:45.3% HbF:52.7% HbA :2.0 %,正常参考值： 成人:HbA 96.597.5%,HbA2 :2.5%3.5%。 注意事项：避免人为血红蛋白污染，Hb浓度最好准确，电泳时间不宜过长，并控制电流不能过大。,3.毛细管电泳,正极,负极,检测器,氘光源 200 nm,约1万伏高压,毛细管 (内径25微米）,进样,-,+,温控装置,电泳方向,毛细管电泳工作原理,阳极,-,阴极,+,电渗流,负电荷,蛋白在毛细管内的运动,正电荷,无论是带正电、带负电或不带电的粒子， 都在电渗流和电场力的共同作用下，向阴极迁移 带正电的迁移最快 不带电的迁移速度次之 带负电的迁移最慢,电场力,毛细管电泳的特点,液相电泳 无染脱色 全自动化 高分辨率 高清晰度 高敏感度 高效率 高通量,Hb A, F and A2 are detected automatically,毛细管电泳下的血红蛋白检测结果图谱,4.高效液相色谱仪 离子交换层析原理 正常出峰时间依次为HbF、HbA和HbA2 国际地贫协会和美国化学学会推荐使用 地贫很好临床价值，地贫有局限性,五、PCR技术检测血红蛋白基因,在分子水平上进行血红蛋白病的诊断和研究,第七节 血红蛋白异常的检验,抗碱血红蛋白检测 HbF酸洗脱法检测 红细胞包涵体试验 异丙醇沉淀试验 血红蛋白电泳 PCR技术检测血红蛋白基因,溶血一般检验 铁代谢检验 叶酸和维生素B12检验 红细胞膜缺陷的检测 红细胞酶缺陷的检验 免疫性溶血性贫血检验 血红蛋白异常的检验 阵发性睡眠性血红蛋白尿症检验,第八节 阵发性睡眠性血红蛋白尿检验,酸化血清溶血试验 蔗糖溶血试验 蛇毒因子溶血试验 血细胞表型CD59/CD55的FCM分析 血细胞Flaer分析,一、酸化血清溶血试验(Ham test),PNH患者RBC膜对血清中补体溶血作用异常敏感，在酸化的血清中(pH6.66.8) 补体溶血效应更为敏感，因此，产生酸溶血现象。 正常人