工业微生物菌种选育及保藏

第一节 工业生产常用的微生物 一、工业生产常用的微生物* · 从自然界中分离出来就能被利用； · 对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 · 使用重组DNA技术改造的菌株 目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。,第二章 生物工业菌种与种子的扩大培养,由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。 尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。 微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种； 微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见潜力是很大的。 在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。,工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌(Brevibacterium) 用于生产： 生产淀粉酶(amylase） 蛋白酶（proteinase） 乳酸(lactic acid) 醋酸(acetic acid) 氨基酸(amino acid) 肌苷酸(inosinic acid), 细菌（bacteria）： 属于单细胞原核生物（ unicellular prokaryote），以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。 细胞生长时，环状染色体（chromosome）被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。 如间隔不完全分裂就形成链状细胞。, 酵母菌（yeast） 酵母菌为单细胞真核生物（ unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。 酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的两个细胞。如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。 工业上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。,真核细胞结构示意图, 霉菌（mould） 霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungi)统称为霉菌。 霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。,生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等； 产品： 酶制剂（enzyme preparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素（steroid hormone） 等。,例如,1、青霉属 青霉素产生菌 点青霉菌产黄青霉菌诱变提高产量 青霉：延胡索酸 葡萄糖酸 2、头孢霉菌 产生头孢菌素C 3、曲霉菌生产有机酸、甾体类转化, 放线菌(Actinomycetes) 放线菌因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。 放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉没培养（submerged cultures）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性的控制，又与环境相关。,在液体沉没培养中由于搅拌器（agitator）的剪应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。它的最大经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics）。从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。 常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。,1、链霉菌属，是产生抗生素最多的一个属 链霉素 灰色链霉菌 红霉素 红色链霉菌 四环素 金色链霉菌 2、小单孢菌 庆大霉素 由绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌产生。,其他生物： A: 担子菌（Basidiomycetes ）：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药物的开发。 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。,B：病毒(virus) 其特点如下： 1. 形体微小，体积比细菌小的多。 2. 没有细胞结构，是一种独特分子的生物，主要由核酸和蛋白质构成。 3. 营寄生生活，由于缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。,人类免疫缺陷病毒 （ human immunodeficiency virus ，HIV ） 获得性免疫缺陷综合症（ acquired immunodeficiency syndrome， AIDS ）,噬菌体（phage）是病毒的一种。 ：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区别。 噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。,C：藻类（alga）： 培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。 培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重的5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。 有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO造成的温室效应。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。,藻 类 工 厂,二、 微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种则有下列要求： (1) 廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。 (2) 易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。 (3) 抗杂菌和噬菌体的能力强。 (4) 菌种纯，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。,在筛选所需的菌种时应考虑的一些重要的指标： （1） 菌种的营养特征： （2） 菌种的生长温度： （3） 菌种对所采用的设备及生产过程的适应性： （4） 菌种的稳定性： （5） 产物的得率和产物的浓度： （6） 产物容易回收： 能满足（3）（6），则有希望成为效益较高的生产菌种。,第二节 菌种的衰退、复壮与保藏,菌种退化是指经较长时间传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。,一、微生物菌种衰退的原因 1. 原因 一是菌种保藏不妥; 二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件； 三是经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征的情况。 连续传代是菌种退化的直接原因，这是由于菌种经常处于旺盛的生长状态。 衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。,2 防止菌种衰退的措施,菌种的分离: 因为在菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的，具有更强的生产能力。 因此，对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落（colony），再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来形状的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。,如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。,如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。 如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。 如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。 同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。,其它防 衰 措 施 菌种的复壮 提供良好的环境条件 使用优良的保存方法 定期纯化菌种,二 、 菌种的复壮,通过分离达到复壮:菌落纯/细胞纯 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混合培养再分离，达到菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到细胞纯 通过寄主体达到复壮: 对于寄生性微生物的退化菌株,将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮。,三、菌种保藏（strain preservation）,基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于休眠状态。 要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。 保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢子（ spore）、芽孢 (gemma)等；其次是要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，使菌体的代谢活动处于最低状态，延长其保存期。,保存方法： 应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。 酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。 霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。短期可采用斜面保藏。 保藏应注意的问题： 菌体状态：休眠体 基质：营养贫乏 操作过程：不应对细胞造成伤害,工业生产中微生物育种的基本方法包括自然选育、诱变育种、抗性菌种选育、代谢控制育种及基因重组定向育种等。 育种就是要改善菌种的特性，使之能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。 代谢控制育种主要有两个方面： 改变代谢通路的育种 改变代谢自动调节系统的育种,第三节 菌种的选育,一、自然选育 采样 增殖培养 从自然界选育菌株 纯种分离 性能鉴定 从自发突变中选育菌株,二、诱变育种 按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种诱变选育的目的。 诱变育种一般采用物理、化学诱变剂使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗转信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。,原种（出发