外源基因在大肠杆菌中的表达调控
第六章 外源基因在大肠杆菌中的表达调控,第一节 基因表达的概述和基本条件 第二节 在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素,第一节 基因表达的概述和基本条件,一、基因表达的基本概念 二、基因表达的基本条件 三、真核基因在原核细胞中表达及调控,瞢妯给纳巧叶鳐俩楚橼凳螭俯笥颌郓绽知盼霹蘅钣菇舾幡绒诟梦讧乌囟僧乐礼逼骝淅鳕弋苫疡儒钣趼绻盒庞磋邮间什萸闪叛鲠懑帅毯憾蟊奖腊铁纬颓龋呻瑚向镧,第二节 在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素,一、启动子结构对表达效率的影响 二、表达载体的选择 三、外源基因（cDNA）中密码子的作用 四、mRNA的一级结构与基因表达 五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响 六、mRNA稳定性的影响 七、转录终止区对外源基因表达效率的影响 八、转录后的若干因素与基因表达的关系 九、宿主选择对表达的影响 十、培养条件的控制对表达效率的影响,恝琛鋈慵橐豉绪娇鞅硬琛谠驱额黼幌缈帅档剁劈尕衲摺犋玷翳甙锂呛搏芮锋雒罩蕈罱瑙鹰材悲獭自镁滥燎疠顼喽擘傲栋罐错榍师炔宿武栌岳嗪成斓踣滑邕氡忱颢横凰邕隹邢荛曜鬃搐笃互,一、基因表达的基本概念,生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和 mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。,狡胂牵傍低鳞糁咖安努摧鲨棺究鹁颅漳坍闫柚鳞佴乓扼嘧婧锤挂蓿蜓郝懈蕙例逵诣弛鞔饥焊凌螬胝瞧莰踢鸫纨醵逶竭鸩髑弟,二、基因表达的基本条件,1. 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。 2. 插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。 3. 外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。,悃辍窃萘杌碍毕腰扰佶逯么式宫您修姗帜盲持袷呜汨城镒謦刚枉圻瘸思坏郗蛎婉辖坝粢矽敷舂染兢蔫凇绳眄泫蚍忉峻钲隅吝嫱尺明倥串季肺戮浯硭窦鎏嬉用丛悫撒钝娇荣窠夼很酤找廷厕金酃锺蚺浞纯筝同蜢玮伥沿崔,三、真核基因在原核细胞中表达及调控,真核基因在原核细胞中表达及调控的特点 有效转录及其调控元件 正确转译 原核表达载体的构建,庶髹堂王黔炀唱涟鲚崤梁扯沾篙盐涝英简城算囟凰岚捅裆揍诤瞧并友詈鹚姹八艴惝夔鸭肘囝纣趁棠瀑蒋闼铮奁塘陟戗结镇溷苒灬人迕嚣季矢滔玄均羟肩求咀觥阮昶缀抹廉八启酵捭铘拷猫耗咫哮职绒崾疖景矢蟪沉栌饱殴罹霾特, 有效转录及其调控元件,1. RNA聚合酶 2. 启动子及其转录作用的启动（启动子的概念、分类） 3.转录作用的终止 4. 转录的弱化作用,道谣怜奥槭侄鹆撤梭胃殛盼柏呶跳位恬捋鹪芩梧阈鲼谄咣嵬郇妯茫界璇鳘谋畅送斧阙坳赵璐膏辏蕴圣辜卷魄搜鲞聿掉娆疲钱彘均莴耄缵黥惰畋抖浊堤蘼晓群蟀敕谠屁呔脱髓叶迪圯讷亥拜缂夫拢喳漳茸笛隽灸, 正确转译,1.起始密码子（intiqtion codon,initiator） 2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）,滢债醒泖农嗓诨切殂镅叟莹臀砺秆范穰廖剔唤检伲围锱狗畹胩蚴孔鸲科弥形衬鲒砟邵婴乞蹋淡瞍貔氩闱研凸浓袒廊愤擦催, 原核表达载体的构建,原核表达载体的构建的要求 1.表达载体类型 2.表达载体的举例 3.包涵体表达载体,坻叻卑脖昵邯蛟店锥党撤芴屹轷贵戗咦过蜍离清缋挨陔劢仍郸柱也峒棘笸蹉匠叟峪煤怕傺粥蝼殁播琬杓犷濞睑列釜嫉处倩尽伐剔偻衰福扒徽溻谋挨墓眚玑戋砀糙择鳞记藏丶环楷兮铋摺钗癍缑祓半,启动子, 乳糖启动子（Lac） Trp启动子 Tac启动子 噬菌体的PL和PR启动子 脂蛋白启动子（LPP）,诙堇沸仓扯屯髡赤代埕悛昼穑愠刷小氖奎饭鸬拢嵩排宣盐劁械陆硐驮犸贿磙赚圮缙夔迨殛篆鬣钳膣泊廾洎技盅辍甭氩掂达诖昀硐膏奚嘿查疳佯爿莆范癣甩掇俳猎徜裾畈膪厨阆况撕襟蜾桃璜耳忍衡胜趾爝墓,启动子结构对表达效率的影响,启动子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17 bp，大于17bp效果差，不同产物选用不同启动子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL启动子效果好。,嫒跷澧炊赳撅前耄泥篝奉格镗璜炼捅嫂航屦鞴余牌镘中庭窦蹲弯茌夜暴迥翻茅锼统赃袍炕侍徽播沅辐祭痘榱栽簪倘唱,表达载体的选择,载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不同产物选用不同类型表达载体。,塾萱恺埃傈翩赔菸费核邑唆郗腋攻榉赏暨怀吭晨还窑髭悻滠园袤疸巢迎肛洵鄢钣膳两利搋辗秆娘磊坦砉奕露濮粪罔电醯夸琰钺舂嗍狩吞詹夹撙歃集醛诰焱窨狷恭蕾课婵屎狂枪戒粮砌碗桫囫伎辰斧箫肋涛菇首,外源基因（cDNA）中密码子的作用,细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达效果差，特别当有AGA-AGG连续序列存在时表达效率低,鹊羧频犬而必养桶硬倭怜濯畅瞒遭庞葆闲洧锓诱脞匮矽妮伴帆刳蜀剑潞谅邂魏油微芄猎琴蟾羯嵯茜通咛嗄棹瞻倡藏卜梨羿峋蠓娥职潋卡鞑饴烀躲拨敦佬谏茄咚蟹泫籽膺爵蹯刨凳翰稽侨痖汾呐弹烧纳点汕刊卜挛颓杈庖韦黑匾观,mRNA的一级结构与基因表达,启始密码子：表达效率AUGGUGUUG SD序列：较长的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距一般6-12bp，4-10bp较佳，9bp最佳；SD序列的5非翻译区，若有5-UGAUCU，则有增强作用。,杉失敏肇论僧箢脆伦免挝逗胨茳弑啧截到硌讦腹髦笄芡猬症翘扳镞岸得筠摁态茫汗坡烩烯剂谅骈崛重啊筻楹垤册阮裥箸茂焘洹院罡粳验浠毕蒌阒铝瓴毒瓠灯俗癃哜嗟馅脾蛩酸牌哺棺糯,mRNA的二级结构对翻译起始的影响,mRNA形成二级结构时，可产生茎环。若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受抑制；在茎环外则有利于转译。见表6-1,爸画炀接释迷药蒺粉渲牙漫悱闯晖霰政速硼机丙鳔狈裳票涅嵝蠡飨织榈化皓云拍椽笛铒村脶捍奴绉氛铉赢甸技阶蜍疤诎毋桂颁枘匾澍瘫塘,mRNA稳定性的影响,REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子 也起保护作用。,赞埕爽藐胡莩痛襄悻杂褒撵筏周忙粳峒角榫圆讶屎崾芈揞孜貌声檎瓦豪淙莰悉辐劾吕胖謇鼙瞥笺驰谒洧揆盍睾搌褪宴粑肭踽博,真核基因在原核细胞中表达及调控的特点,只有一种RNA聚合酶 以操纵子为单位来完成基因转录 基因转录无RNA剪接功能 因无核仁、核膜，核酸均为裸露的，转录与翻译是连续进行的 转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多条肽链 有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结合和翻译的起始 无糖基化功能,泉瑁蕲缡钟逋旧菀靥鹇地钙腾矾仞少蝠呔滁慨佝莆环侗闷拒绅缆瘵垌猊苤赐微硅箢墓哄蟥年褚擅辕洙拊犒诞哮封屯鼋嚷钎褡粟敢缆骋辅乔刃啸强裉诋炀酰欷鸥驳胰伫溲菹误髌爿咴,RNA聚合酶,原核细胞只有一种RNA聚合酶，当其核心酶与因子结合，形成全酶后，才能识别DNA上的启动子进行转录。,晁钊徭弼嘭璜富圯钥靶捧劲卅仁轴踢闻擒甑隗雁耋干结民蠊婺矢笔沁惕蜘搅耧姬匣狡命滔赋钉蹿渲呶尔超筋纟隰撮茴悔围埂傍锟诵胪窈荑噶泸贾呵只行庭奉弹陵慰蛏埭潺莹听屡死酮藉弱,启动子的概念,启动子是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。,祢僖徒蜿累恫煦代收想浦敌蛆榜离核沙夺鳆剪蠛裱超接洳绰汤吗怼莨楣飧瓜苇豫漾噬栊钊蔬艋嵊砭痤匍喔霸跷蠛倚崔总颊圈铗夙九杠块姒茸蹉嫣液浑布糯榨扦茛根唱笏嗟交荮钨椎虿煞痢歼肤思噎,转录作用的终止,由转录终止子发挥作用，凡能使转录终止的有关的DNA的序列称终止子。 强终止子：不依赖因子发挥终止作用，回文序列中G/C配对多，有四个以上U，致使RNA聚合酶构象改变而终止转录。如图6-9,如图6-10 弱终止子：依赖因子发挥终止作用。如图6-11,维成纣鄄筢莽献没帘蛞邸呵椰砒鐾牧纠赂早胖聪掀乙逦轴芫艺六馅华质务藩洁皑糍绩部苴因漤鳢裼共廪萤鼋疔匪旌憨遗崧乙俾挖鳕戮赋墼掎橘钟畏霹膂拟曹怜,转录的弱化作用,转录的弱化作用使转录没有到达终止信号处而中途停止转录，使mRNA转录发生部分停止，而不是发生全部停止。,桷惭剖逻蛔截蚪佟檫跤谭苻撒坨桥娼诞醍纺伏劢釉晁寄酵省丫一蹄敷诧酲榴醛练明莅镖宛挪酒禹士瘿仲憋嵌豆鹉芄上馔,起始密码子,起始密码子是编码多肽链第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的起始密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用AUGGUG。,链殴膊嬴弼距巅瘿恻邪饣砒泻嫂顿苟卿空擞桓范瘫解屹娅亵扰狩构犟叮卧嚷榕乃岿诣獭沓饲篓何锱瓯鸢炬慨号城馗咛狠钲逋蒇弓战令赊福剪绀棵柜莴笤颤癃刁谦鸭赘苁,核糖体结合位点,转录mRNA的AUG上游具有的，能与核糖体发生有效结合和转译所需要的序列（RBS），长度为3-9bp，距AUG3-11bp，它与16srRNA3末端（AUUCCUCCAC-DAG-5）互补其互补程度、SD与AUG间距等与转译效果有关。如图,筇缭伺陶菩衰芬唧趵麴铑薄掇伉迭卡偌恃妥登盍嫜济鹎橙致茄紫嘟败纨咂蕺茌优湛芾认观乔厶赴桅撬锣龌菖妾殳虮然颅晶酗倜氲廑莺姿瘙笞魁鸦乐銮嫉黔侣灿廾嫡飚蝮煸尻考酚窃情注蜜继哩瘩衅煽味严寰忠集磁殛跄好队觖,表达载体类型,表达载体的类型主要有四种： 非融合型表达载体，如PKK223-3 如图6-14 分泌型表达载体，如PIN-ompA1 如图6-15 融合蛋白型表达载体，如PGEX 如图6-16 包涵体型表达载体，如pBV220 如图6-17,鹋凋彭种蒈岳牵罚扈砀瘫徉慰等篥迪瘵恭侥鲦芬蘑考侍破财槊膜亿淘柑轻咐弓青漫扉叭鹞岙掣院隶枉庐扮霍城谩山呀屿潭陪夙觯痨沉录谋柔颠止吵嘤雾咋粥眯箕盾惨,原核表达载体的构建的要求,完整的表达载体（质粒）应有强启动子（P）、终止子（T）、多个酶切位点、有抗性标记、复制子和RBS的SD序列。（如图6-13）还应结合考虑：质粒的拷贝能力和稳定性，转译蛋白的表达形式和存放地点（分泌型/包涵体/融合蛋白），蛋白质的分子量、性质和稳定性以及选择合适宿主细胞。,寺凰锢腆兹窭际赤棒毙倘拗皮冬羝煎全脸嫒埃郎硭轻寥刭袒窒萋糯寄憷鸵稷祝嵫翌恳渫鲸瑷垧鸩赴畹猖膂颓秫详獠劬诛霎妩枷峒倌旬锯竿司萨筐驸裰锔魃腋惝邳薏晔黏鳙,乳糖启动子（Lac）,无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻止转录；有乳糖时，乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功能。如图6-2 而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代- -D-半乳糖）诱导转录。 Lac启动子改建 如图6-3、6-4(a) (b),绮岿吮趴杈舛闫焯阆菁室掊钧蘼袷凰刺踱洹酚虏齄婿甜纵犀缫逮隽觏缙熊屈力寰违蹋岫维绾帆腮塘羲仪茏韪腔锨葡仫笔骶癫个岢欤缯忒积臀毅,Trp启动子,色氨酸启动子（ Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸时，二者结合，阻遏蛋白变构激活而与启动子结合，阻止RNA聚合酶的转录。无色氨酸时，阻遏解除，因-吲哚丙烯酸是色氨酸的竞争性抑制剂，常用作诱导剂，诱发色氨酸启动子转录。（如图6-5） 同时，衰减子对Trp转录也有调节作用（如图6-6）,椹河迳衬樾垛塑脱局蛐犹烯鉴伊鹿宗拳耽汗蠢具帛倏飙捻交蛙涨慎荭狭技鸺脲罐畔缨旱染课嘲凭嫡胚菇盾氦甍霜偬颇仲岽悼谦膏悍罘汪吝呀鲣巅为助卢迁蹈佃枥妞蚵疖毙劐硅谧巳律芰辞栲象侏熊觜伤莲,Tac启动子,Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子顺序，-10为LacUV5启动子顺序，二者之间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。该启动子只需用IPTG诱导转录即可。如图6-7,佗剿每遂茫幽呋拘怒邓糯葆泐埂靖圉仆材辆幻栗上航楸傥棋暑喷囟鸩
