酶工程：酶非水相催化

酶非水相催化,酶 工 程,观念的改变,有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。 近年来，进行了非水介质的酶结构与功能、酶作用机制、酶作用动力学的研究，建立起非水酶学（non-aqueous enzymology)。,第一节 酶非水相催化的研究概况,受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同。,酶的非水相催化主要包括:,一、有机介质中的酶催化； 二、气相介质中的酶催化； 三、超临界流体介质中的酶催化； 四、离子液介质中的酶催化,一、有机介质中的酶催化,指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用范围:底物、产物两者或其一为疏水性物质的酶催化作用。 原因:酶在有机介质中基本能保持结构的完整。 特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性、热稳定性等有所改变。 应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子合成、手性药物拆分的研究。,二、气相介质中的酶催化,指酶在气相介质中进行的催化反应。 适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质的酶催化反应。 特性：气体介质的密度低，扩散容易，与在水相中明显不同。,三、超临界流体介质中的酶催化,酶在超临界流体中进行的催化反应。 超临界流体是指温度和压力超过某物质的超临界 点的流体。,要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性；温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。 常用的超临界流体有：CO2, SO2 C2H4, C2H6 C3H8 C4H10 等。,四、离子液介质中的酶催化,指酶在离子液中进行的催化作用。 离子液 (Ionic liquid )是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的、在室温下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，稳定性好。 特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。,第二节 有机介质中水和有机溶剂 对酶催化反应的影响,1、微水介质体系； 2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系； 3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 4、（正）胶束体系； 5、反胶束体系。,一、有机介质反应体系,1、微水介质体系,是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系。 微量的水主要是酶分子的结合水,对维持酶分子空间构象和催化活性至关重要。 另一部分水分配在有机溶剂中。 酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中，是常见的有机反应体系。,2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系,由水与极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系。 水与有机剂含量均较大。 适用的酶较少。,3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系,由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系； 游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。 固定化酶在界面； 催化反应在两相界面进行； 适于底物或产物两者或其中一种属于疏水化合物的催化反应。,4、正胶束体系,大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。 表面活性剂的极性端朝外,非极性端朝内,有机溶剂被包在液滴内部。 酶在胶束外面的水溶液中,疏水性的底物或产物在胶束内部,反应在胶束的两相界面中进行。,5、反胶束体系,反胶束: 在与水不互溶的大量有机溶剂中,加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴； 1997年首次报道酶在反相胶束中具有活性(已发现40多种酶)； 酶分子处在反胶束内，稳定性好； 反胶束与生物膜有相似之处，适用于处在生物膜表面或与膜结合的酶的结构、催化特性和动力学性质的研究。,二、水对有机介质中酶催化的影响,有机溶剂中酶的催化活力与反应系统的含水量密切相关。 系统含水量:结合水(酶粉水合、固定载体和其他杂质)、游离水(溶于有机溶剂) 与酶结合的水量是影响酶的活力、稳定性以及专一性的决定因素,1、水对酶分子空间构象的影响,无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层; 必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低水量; 不同的酶所需求的必需水的量差别较大; 每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶却需3.5×102个水分子 原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的。,2.水对酶催化反应速度的影响,典型的非水酶体系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。 水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定性。,三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响,直接或间接影响酶的活性和稳定性。 改变酶的特异性（底物特异性、立体选择性、前手性选择性等）。 通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的特性。,1. 有机溶剂对酶结构与功能的影响,在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象； 有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同。 有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏； 有的酶分子则保持完整；,（1）有机溶剂对结合水的影响,一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面的必需水而导致酶失活。 由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关。 提高酶分子的亲水性，可以限制酶在有机溶剂中的脱水作用。,2. 有机溶剂对酶活性的影响,、溶剂对底物和产物分配的影响,溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。 溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。 有机溶剂极性小，疏水性强，则疏水性底物难于进入必需水层； 有机溶剂极性过强，亲水性强，则疏水性底物在有机溶剂中的溶解度低。 故选择2lgp5的有机溶剂作为有机介质为宜。,第三节 酶在有机介质中的催化特性,有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平衡,从而影响到酶的结合部位。 有机溶剂会改变底物存在状态。 结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选择性,区域选择性和化学键选择性。,2、底物特异性 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。 例如：青霉脂肪酶 在正己烷中催化2-辛醇与不同链长的脂肪酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具有较强的特异性。,一、底物专一性,(1)有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状态发生改变,致使酶的底物特异性发生改变: 水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用; 有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;,(2)不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样: 极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反应; 极性较弱的有机溶剂中,疏水性较弱的底物易反应;,3、对映体选择性 酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力。 有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变。 疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差。 例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸。,二、对映体选择性（enantioselectivity),对映体选择性意义： 例如：某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L-氨基酸。,三、区域选择性（regioselectivity）,酶能够选择性地催化底物分子中某个区域的基团优先发生反应；用区域选择系数的大小衡量。 用1、2代表底物分子的区域位置； 区域选择系数： K1，2=（kcat/Km)1/ （kcat/Km)2,例：,四、键选择性（chemoselectivity),即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶反应，酶对其一优先反应。,6-氨基-1-已醇,黑曲霉脂肪酶,毛霉脂肪酶,羟基酰化,氨基酰化,占优,五、热稳定性 有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。 例如： 猪胰脂肪酶（PPL）在苯中催化酯交换反应时， （1）酶活性随温度升高（2070）而增加， （2）在70连续反应7次（每次96 h）后酶活力仍保持 60， （3）在100时的半衰期可达数十小时，而在水中100几乎马上失活。 PPL的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度， 1的水，会使PPL的稳定性降低到和水溶液中相同的水平。,六、pH值特性,在有机介质中酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同，称为pH印记或pH记忆（pH-imprinting）; 现象：脂肪酶催化三丁酸甘油与正庚醇的转酯反应，酶的反应速度与其冷冻干燥前水溶液的的PH密切相关，反应的最适PH接近于水溶液中的最适PH,原因：当酶分子从水溶液转移到有机介质时，原有的解离状态不变，被保持在有机介质中； 有机介质中酶催化反应的最适ph通常与在水溶液的pH接近； 但有些有机溶剂中酶的最PH与水溶液中相差较大，还与缓冲液种类和离子强度有关;,第四节 有机介质中酶催化反应的 条件及其控制,酶在有机介质中的催化反应受各种因素影响，主要有酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度、pH值和离子强度等。,一、有机介质中酶催化反应的类型,1、合成反应 2、转移反应 3、醇解反应 4、氨解反应 5、异构反应 6、氧化还原反应 7、裂合反应,1、合成反应,有机介质中水含量极微，可催化水解反应的逆反应； （1）脂肪酶或酯酶催化有机酸和醇进行酯的合成反应：,意义:酶催化酯合成可合成手性化合物,且酶的立体选择性主要是选择立体异构的醇。,（2）蛋白酶可在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成多肽,2、转移反应,如脂肪酸催化酯与有机酸反应生成另一种酯与有机酸,即转酯反应：,3、醇解反应,假单胞脂肪酶催化酸酐醇生成二酸单酯化合物,即酸酐水解反应,例:,4、氨解反应,如脂肪酶催化酯类进行不对称氨解反应：,R-苯丙氨酸甲酯,酰胺,叔丁醇,5、异构反应,如消旋酶催化一种异构体为另一种异构体,例,6、氧化还原反应,（1）单加氧,（2）双加氧,（3）催化醛类或酮类还原成醇类,（1）单加氧,（2）双加氧,（3）催化醛类或酮类还原成醇类,7、裂合反应,如醇腈酶催化醛与氢氰酸的反应,二、酶的选择,1、不同酶具不同结构和特性，同一种酶由于来源、处理法不同特性亦有差别； 2、酶反应速度与酶浓度成正比； 3、另注意酶的稳定性、底物专一性,对映体选择性、区域选择性、键选择性等,三、底物的选择和浓度控制,1、有机剂与水中酶的底物专一性不同； 2、底物浓度对酶催化速度有明显的影响； 3、有机介质中要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况； 4、高浓度底物会对反应产生不利影响。,四、有机溶剂的选择,1、有机剂的极性要选择恰当： 极性过强,夺取较多酶表面水分子,使疏水性底物溶解度降低; 极性过弱,底物难以进入必需水层; 故取中间: 2lgP5,2、与水混溶的有机介质其含量对酶催化有影响。 与水混溶的二氧六环介质,辣根过氧化酶(HRP)催化对苯基苯酚的聚合反应,随着二氧六环的含量增加,酶催化得到的聚合物的分子量也增加,80%时最大。,五、含水量的控制,当其它因素不变时，系统含水量对酶活性有影响，只有在最适含水量时酶才有最高活力； 最适水含量通常随溶剂极性增大（lgP减小）而增大；,1,1-已烷 2-四氯甲烷 3-甲苯 4-苯,六、温度的控制,1、微水有机介质中含水量低，酶的热稳定性增强，其最适温度高于水溶液中催化的最适温度； 2、温度低，酶的立体选择性高。Lam和Keinan的实验结果支持此结论；,七、pH值的控制,酶在有机介质中的最适PH值通常与在水溶液中催化的最适pH相同或接近； 可通过调节缓冲液pH的方法调节有机介质中酶催化的pH值； 酶在冷冻干燥过程中，pH状态有变化； 希令（hilling)发现缓冲液对冷冻干燥过程中pH值和酶活力有影响，故加入一定量的蔗糖、甘露醇等冷冻干燥保护剂； 在酶液冻干之前或催化过程采取保护措施； 加有机相缓冲液可对有机介质中酶反应的pH调节。,第五节 酶非水相催化的应用,酶非水相催化应用,一、手性药物的拆分,手性化合物指化学组成相同而立体结构互为对映体的两种异构化合物； 手性药物指只含单一对映体的药物； 已经发现很多手性药物的对映体具有不同的药理作用。 过去手性药物多较是以消旋体形式出售。 1961年欧洲出现了孕妇服用多消旋体的“反应停”后，产生多起畸形胎事件。 1992年美国食品与药物管理局（FDA）明确要求