酶工程：微生物发酵产酶

微生物发酵产酶,本章主要内容： 酶的生产方法； 酶生物合成的基本理论； 发酵产酶的工艺条件及控制；,难点： 酶生物合成的诱导和阻遏； 发酵过程细胞生长与酶合成之间的关系。,重点： 酶生物合成的基本理论； 微生物发酵产酶工艺。,微生物发酵产酶,目前工业用酶大多数来自微生物。经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞的生命活动获得所需酶的技术过程称为酶的发酵生产。 酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。,酶发酵生产的前提之一：选育到性能优良的产酶微生物！ 对产酶微生物的要求： （1）产酶量高； （2）易培养和管理； （3）产酶性能稳定； （4）利于酶产品的分离纯化； （5）安全可靠、无毒性等。,酶发酵生产的类型,1、固体培养发酵：主要适于各种霉菌的发酵产酶 培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。 exp: 麸皮、米糠 酒曲、酱油曲 淀粉酶、蛋白酶 优点：设备简单，操作方便，酶浓度高。 缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。,2、液体深层发酵（目前酶发酵生产的主要方式 ） 液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。,适于微生物、动植物细胞。 优点：机械化强度高，酶产率高，产品回收率高 缺点：技术管理要求高,3、固定化细胞发酵（70年代后期发展） 将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。 优点：细胞密度高，可反复使用，利于产品分离纯化 缺点：需要特殊的固定化细胞反应器，只适用胞外酶生产 4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展） 原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。 优点：解除细胞壁扩散阻碍；易于细胞间质中的酶的 分泌；可反复或连续使用 缺点：制备复杂，维持较高的渗透压，需防止细胞壁再生,第一节 微生物细胞中酶生物合成的调节,一、酶生物合成的基本过程,DNA,RNA,蛋白质（新生多肽链）,成熟蛋白质（酶）,胞内,胞外,转录,翻译,加工,分泌或定位,二、酶生物合成的调节,定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度 的调节机制，主要是在基因转录水平上进行的。 意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,按酶生物合成的速度，把细胞中合成的酶分为两类：,(适应型酶、调节型酶),1960，Jacob和Monod提出的操纵子学说阐明； 与生物合成相关的四个基因： 调节基因Regulator gene ； 启动基因Promoter gene ； 操纵基因Operator gene； 结构基因Structural gene ；,调节基因(R)： 可产生一种变构蛋白，通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。,启动基因（P）（启动子）： 有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢物活化剂蛋白，又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。,操纵基因（Operater gene）: 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。 结构基因（Structural gene）: 决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。,酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏,1、酶合成的诱导作用,加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为诱导作用。,诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。,例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成,2、酶合成的阻遏,（1）终产物阻遏 指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。,（2）分解代谢物阻遏 是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。,葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成 果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成,A1 B1,A2 B2,E,×,色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶,三、酶生物合成的模式,微生物细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段,调整期,对数生长期,平衡期,衰亡期,时间,细胞数量的对数,（一）微生物生长曲线（Microbial growth curve）,（二）酶生物合成的模式,（1）同步合成型 （2）延续合成型 （3）中期合成型 （4）滞后合成型,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶的 生物合成的模式分为4种类型：,1、同步合成型,酶的生物合成与细胞的生长同步进行，又称生长偶联型。大部分组成酶和部分诱导酶的生物合成属于同步合成型。,特点： （1）发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。 （2）生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。,2、中期合成型,酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期后，酶的合成也停止。,特点： （1）该类酶的合成受分解代谢物阻遏。 （2）该酶对应的mRNA不稳定。,3、延续合成型,酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。,特点： （1）该类酶不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。 （2）该酶对应的mRNA是相当稳定的。,4、滞后合成型,只有当细胞生长一段时间或者进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。,特点： （1）该类酶受分解代谢物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。 （2）该酶对应的mRNA稳定性高。,属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。,酶生物合成与生长关联式比较,生长开始,对数期,生长开始,平衡期,衰亡期,平衡期后,平衡期,平衡期,同起同停,晚起晚停,同起晚停,晚起同停,非偶联,过渡,偶联,紧密偶联,很稳定,较稳定,不稳定,不稳定,小结：,影响酶生物合成模式的主要因素：培养基中阻遏物的存在和mRNA的稳定性。,（1）不受培养基中某种物质阻遏时，可随着细胞生长而开始合成；受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入平衡期后，解除阻遏，酶才开始合成。,（2） mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。,选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。,改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件：,（1）同步合成型： 适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。,（2）中期合成型： 要从解除阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力。,（3）滞后合成型 在发酵过程中要尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。,选择与改造,第二节 产酶微生物的特点,用于酶发酵生产的微生物必需具备的条件： （1）酶的产量高 （2）容易培养和管理 （3）产酶稳定性好 （4）利于酶的分离纯化 （5）安全可靠,新开发的酶必须按规定进行下表的各项检查,（一）常用的产酶微生物,1、细菌 大肠杆菌（Escherichia coli） 形态：杆状，革兰氏阴性，运动或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。 大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。 易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。 应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。,醋酸杆菌（Acetobacter）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，不生芽孢。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆 ),枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜。 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶。,2、放线菌(Actinomycetes) 放线菌是一类具有分支状菌丝的单细胞原核微生物,由于菌落呈放射状而得。 放线菌是一类介于细菌和真菌之间的单细胞生物。一方面,放线菌的细胞构造和细胞壁的化学组成与细菌相似,与细菌同属原核生物;另一方面,放线菌菌体呈纤细的菌丝状,而且分支,又以外生孢子的形式繁殖,这些特征又与霉菌相似。放线菌菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状生长,因此叫放线菌。,放线菌产酶举例 链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。,3、霉菌（molds） 霉菌:是一类丝状真菌。构成霉菌菌（个）体的基本单位称为菌丝（hyphae），呈长管状，可不断自前端生长并分支。在固体基质上生长时，部分菌丝深入基质吸收养料，称为基质菌丝或营养菌丝；向空中伸展的称气生菌丝，可进一步发育为繁殖菌丝，产生孢子。大量菌丝交织成绒毛状、絮状或网状等，称为菌丝体（mycelium）。菌丝体常呈白色、褐色、灰色，或呈鲜艳的颜色，有的可产生色素使基质着色（如赤霉菌等）。霉菌繁殖迅速，常造成食品、用具大量霉腐变质，但许多有益种类已被广泛应用，是人类实践活动中最早利用和认识的一类微生物。,选用不同的霉菌作为发酵菌种，不仅可以酿制酱、酱油、醋、豆腐乳等食品，还可以应用于生产有机酸、酶制剂、维生素、生物碱及激素等多种产品; 据统计，在550种酶制剂中有近1/3是霉菌产生的。,霉菌与产酶,霉菌产酶举例,生产糖化酶、 -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、过氧化氢酶、脂肪酶等；,黑曲霉（Aspergillus niger）,米曲霉（Aspergillus oryzae ）,生产糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。,红曲霉（Monascus）,生产-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。,青霉（Penicillium）,青霉是世界分布最广的几类真菌之一。生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。 (一)生活习性 青霉通常在柑桔及其他水果上,冷藏的干酪及被它们的孢子污染的其他食物上均可找到,其分生孢子在土壤内,空气中及腐烂的物质上到处存在，青霉营腐生生活。,(二)形态 青霉的营养体为无色或淡色的菌丝体,菌丝各细胞之间有横隔膜。整个菌丝体分为伸入营养基质中吸取营养的基质菌丝和伸向空气中的气生菌丝。在气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗, 分生孢子为球形至卵形,呈绿色,蓝色或黄色,即通常看到的各种青霉菌落特有的颜色。,木霉（Trichoderma）,木霉具有较强分解纤维素能力。在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传播蔓延迅速。棉籽壳、木屑、段木都是其良好的营养物。 生产纤维素酶的重要菌株。,根霉(Rhizopus),根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。 分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。 应用：根霉能产生糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶等。,4、酵母 啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。 假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。,（二 ）生产菌种的来源,（1）样品的采集（采样）：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等 ；,产酶菌种筛选步骤：,2、筛选 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选 。,（2）初筛：分离产目的酶的菌株； 给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。,产-淀粉酶菌株的筛选,产蛋白酶菌株的筛选,（3）复筛：从所得菌株中筛选优良株； 在初