普通白菜开花系统

分类号 S634.3学 号 20112224 硕 士 学 位 论 文 普通白菜开花系统建立及抗除草剂转基因品种的获得 付 超 导师：李梅兰 教授学科·专业：蔬菜学研究方向：蔬菜育种及生物技术答辩日期：二一四年六月中国 山西 太谷Shanxi Agricultural UniversityMaster Degree DissertationEstablishment of the blossom system and obtaining of herbicide resistant transgenic variety in pak choiChao FuSupervisor: Prof. Meilan LiMajor: Vegetable Science Research Field: Vegetable Breeding and BiotechnologyTaigu Shanxi ChinaJune，2014资 助 项 目本论文由高等学校博士学科点专项科研基金项目（20131403110006）、山西省回国留学人员科研资助项目（2013-062）和山西省教育厅留学项目共同资助。目 录摘 要1第一章 文献综述21 遗传转化方法研究进展21.1 农杆菌介导的遗传转化法21.2 外源基因直接导入法32 2 利用蘸花法进行遗传转化的影响因素52.1植株的生长状态52.2表面活性剂的类型和浓度52.3 蔗糖浓度62.4浸渍次数63 本项目研究背景及目的意义6第二章 普通白菜开花系统的建立81 材料与方法81.1试验材料81.2萌动种子低温处理81.3开花观察及幼苗的管理82 结果与分析92.1不同春化天数对杭州油冬儿抽薹开花的影响92.2不同春化天数对75 #抽薹开花的影响102.3不同春化天数对78 #抽薹开花的影响112.4不同品种春化特性比较133 讨 论134 结 论14第三章 普通白菜转基因选择剂的浓度筛选151材料与方法151.1试验材料151.2试验试剂151.3不同浓度Basta对普通白菜幼苗生长的影响151.4不同浓度卡那霉素对普通白菜幼苗生长的影响162结果与分析172.1喷施不同浓度Basta对杭州油冬儿幼苗生长的影响172.2喷施不同浓度Basta对75 #幼苗生长的影响182.3 喷施Basta对不同品种普通白菜生长的影响192.4不同浓度卡那霉素对杭州油冬儿幼苗生长的影响202.5不同浓度卡那霉素对75 #幼苗生长的影响212.6卡那霉素对不同品种普通白菜幼苗生长的影响223 讨论233.1 Basta浓度对植物生长的影响233.2喷施次数对植株生长的影响233.3卡那霉素浓度对植株生长的影响244 结论24第四章 抗除草剂转基因品种的获得251材料与方法251.1材料251.2方法262 结果与分析282.1结籽情况调查282.2筛选抗性植株302.3抗性植株GUS基因表达检测302.4抗性植株的分子鉴定302.5 T2代植株GUS基因表达检测312.6 T2代植株幼苗的分子鉴定323 讨论323.1蘸花时间对转化效率的影响323.2蘸花次数对转化效率的影响323.3喷水处理对转化效率的影响334 结论33参考文献34Abstract39在研期间发表论文41致 谢42普通白菜开花系统建立及抗除草剂转基因品种的获得摘 要普通白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)属于十字花科芸薹属，营养丰富，具有多方面的保健功能。随着转基因技术的日益成熟，应用生物技术选育新品种已经获得很大的成功。由于普通农杆菌介导转化方法较为繁琐，因此蘸花法成为人们首选的转化方法并已在拟南芥中获得成功。因此，本论文以杭州油冬儿、75 #等2个品种（系）为试材，建立了普通白菜开花系统；利用根癌农杆菌GV3101(含pCAMBIA3301)研究了蘸花法转化普通白菜的选择剂浓度以及影响因素，获得了抗除草剂的转基因白菜。具体研究结果如下：1. 为了建立普通白菜的开花系统以进行相关的研究，以杭州油冬儿、75 #和78 #等3个品种（系）为试材，将3个品种的萌动种子分别进行10、20、30 d低温处理，观察处理后普通白菜的现蕾始期、现蕾时平均叶片数、开花始期、半数花期和某一时间的现蕾率等，以研究不同春化天数对普通白菜开花的影响。结果表明，促进杭州油冬儿和75 #普通白菜开花的最佳低温处理时间为20 d，而78 #为30 d。比较低温处理20 d后各品种的开花表现，发现杭州油冬儿和75 #基本相同，而78 #开花时间比杭州油冬儿和75 #分别晚13和16 d，因此在开花研究中宜采用前2个品种（系）。2. 为了确定选择剂浓度以进行转基因植株的筛选，以杭州油冬儿和75 #2个品种（系）为试材，对转基因选择剂卡那霉素和除草剂Basta的浓度进行筛选。试验结果表明，杭州油冬儿和75 #对Basta敏感性几乎相同，喷施Basta溶液的最适浓度均为0.002 %，最佳喷施次数为7次。杭州油冬儿和75 #对卡那霉素的抗性筛选最适浓度分别为100 mg/L和75 mg/L。3. 利用蘸花法对普通白菜进行遗传转化，并对影响遗传转化效率的各个因素进行了研究，结果表明，经过低温处理20 d的植株，在少数花开放的蕾期时对植株进行蘸花处理，蘸花后次日不对花序进行喷水，7 d之后再蘸一回的处理组合获得转基因植株。蘸花时间以2.5 min最佳；蘸花次数以2次且进行蘸花的时间间隔以7 d为宜。通过抗性植株的PCR检测，确定目的基因已整合到普通白菜基因组中，这为今后普通白菜的遗传转化奠定基础。关键词：普通白菜；开花体系；蘸花转化；GUS表达第一章 文献综述普通白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种1-2，一年生或二年生草本植物，以绿色的柔嫩叶片和多汁的叶柄为食用部分。在我国，白菜的栽培历史悠久，是秋冬季节北方地区的重要蔬菜之一。它的产品不但鲜脆爽口，而且营养极为丰富，同时还具有多种药用和保健功能。如普通白菜中富含有丰富的对人体新陈代谢和生长发育有益的矿物质元素 3；其中含有的烟酸、维生素、胡萝卜素和泛酸等对皮肤粗裂及松弛精神紧张有一定的疗效4；而富含的氨基酸及锌、铜、镁等多种微量元素，不仅有利于心血管疾病的预防，降低癌症的患病率，此外还有抗氧化、抗衰老、降血压和降血脂等多种功效5。由于适应性强、生长期短、较易栽培和产量高等特点，普通白菜已经成为我国重要蔬菜栽培作物之一。随着经济的发展和人民生活水平的提高，不但要求其品质优、营养价值高，更要求低农药残留对人体身体健康危害少的绿色蔬菜。因此，这些都对普通白菜育种提出了越来越高的要求。在20世纪70年代前蔬菜的遗传改良主要是通过杂交诱变等传统育种方法来实现的。但由于这些传统方法育种年限长、可利用的种质资源有限，以及通过形态观察来选择费时又费力，极大的限制了使植物遗传改良的快速发展。随着近几年细胞生物工程和基因工程的兴起，为蔬菜作物的品种改良开辟了一条新途径。生物技术与常规育种的结合，不仅使蔬菜作物育种周期变短、后代选择稳定，而且增强了作物的育种目的性，大大提高了育种的效率，为培育优质品种提供了新的技术手段。目前有关芸薹属中许多种的遗传转化研究已取得了一定的进展，现综述如下。1 遗传转化方法研究进展目前，有关植物遗传转化的方法已有颇多报道，其研究表明，在不同的遗传转化方法之间其转化率具有较大的差异，且对同一方法而言，不同植物间的转化率也不尽相同。提高遗传转化率是研究的关键，因此，选择适宜的遗传转化方法显得尤为重要。迄今为止，主要的方法有农杆菌介导的遗传转化法和外源目的基因直接导入法两大类。1.1 农杆菌介导的遗传转化法目前农杆菌介导的植物遗传转化是使用最为广泛的体系6。该方法以农杆菌为媒介，将目的基因通过载体上的特定区域导入细胞，并整合到染色体中7-8。目前常用的农杆菌菌株主要是发根农杆菌和根癌农杆菌这两种。在植物基因工程中又以根癌农杆菌的Ti质粒所介导的遗传转化为最多，在转化时常用的方法有以下3种。.1.1 原生质体法原生质体法是将原生质体与携带有目的基因的农杆菌进行共培养。在此过程中农杆菌的T-DNA由信号分子诱导进入原生质体核，T-DNA就可能与受体基因组进行整合9，从而获得转化植株。戴大鹏10等利用大白菜的真叶作为再生外植体，预培养3 d、共培养2-3 d，GUS瞬时表达率达到59 %以上，目的基因的转化率为0.7 %。而秦新民11等也成功的应用此法对小白菜的愈伤组织进行了转化，其转化率达0.64 %。虽然原生质体法转化率较高，且无嵌合体，可应用于任何植物中；但该方法需经过组织培养阶段，操作较为复杂、植株再生难度大。因此，不适合通过组织培养再生困难的植物。1.1.2 真空渗入法真空渗入法是将植株的花序浸没于农杆菌菌液中，再利用真空泵进行抽真空处理，为农杆菌侵入植物体营造有利环境，从而获得转基因植株。该方法最早是Bechtold等12以拟南芥为材料进行遗传转化，并成功获得转化植物。曹传增等13也采用此方法成功获得了不结球白菜的转基因植物，同时得出采用胭脂碱型农杆菌，真空处理时间为5 min，其转化效率最高，能达到10 %。虽然真空渗入法的转化效率高，且不需要建立植株的再生体系，操作简单易行，但由于受真空容器大小的限制，故不适用于体形较大的材料。另外，在真空处理后移栽缓苗的过程中,往往会出现有许多花序甚至是整个植株的死亡,使种子的结实率受到限制。所以，使用真空渗入法也存在许多局限性。1.1.3 蘸花法由农杆菌介导的蘸花转化法是在真空渗入转化法的基础上发展起来的一种简便的遗传转化法。Clough等14首次利用蘸花法成功转化了拟南芥，其研究表明，转化成功需要选择适合的表面活性剂及适当的浓度、合适的植株生育期和蔗糖浓度3个条件。Curtis等15也成功采用该方法对萝卜进行了转化，并获得了转化植株，并且发现在主花序中的转化效率最高。Chung等16通过对拟南芥的花序喷施农杆菌菌液，同样也获得了转化植株，并提出在植株体型较大时，该方法更为简便易行17-19。蘸花遗传转化法有诸多优点，其具体表现为，(1)不受植物种类的影响，无需经过繁琐的组织培养，可将外源基因导入难以建立再生体系的植物体内；(2)操作简单易行，对精密仪器和高昂药品的依赖程度较小；(3)可从后代的种子中直接筛选出抗性植株，简便、快速、可靠，为植物的转基因研究开辟了新途径。目前，蘸花法已经在禾本科的黑麦和小麦17、萝卜15、芥菜18、甘蓝型油菜19等多种植物中得到了成功应用。1.2 外源基因直接导入法该类方法法与农杆菌介导遗传转化法最大的区别在于，其通过一定的技术手段和方法可直接目的基因导入受体或组织细胞，从而方便快捷的完成植物的基因转化20