薄层色谱法(tlc)讲稿(精品)

薄层色谱法(TLC)的规范化技术要求,1.什么是薄层色谱法？,系将适宜的固定相(吸附剂或载体)涂布于玻璃板、塑料或铝基上，使成一均匀薄层，待点样、展开后，与适宜的对照物按同法在同板上所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。,薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01g）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。,因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行药物合成反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。,TLC与HPLC相比，一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性，流动相的选择的目的是使绝大部分样品的Rf值位于0.10.7之间并达到较好的分离，与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。流动相强度越大，溶质Rf值越大，但很可能降低分离能力；另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物、根据相似相溶原理，要使用多元溶剂体系。,薄层色谱的特点： 灵敏度及分辨率高、分离快速、操作方便、同时分离多个样品、样品预处理简单、设备简单。由于这些特点，薄层色谱在实际工作中的应用十分广泛。,一般展开剂体系选择如下：根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系，通过调节溶剂比例以寻求适合Rf值，适合的Rf值找到后，再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个，以这三个组成为三点组成一个三角形，则可看到：三角形顶点是二元体系，边是三元体系，三角形内是四元体系，并且极性一致，可根据几何原理得出任一点组成，这种方法较为直观，也较简单。,I0,I2,I1,前沿,原点,薄层板示意图,比移值 ：,Rf=,组分移动距离,溶剂前沿移动距离,Rx=,样品Rf值,参照物的Rf值,相对比移值 ：,2.仪器与材料,薄层板 点样器 展开容器 显色设备 色谱检视装置,2.1薄层板,2.1.1薄层板分类 预制薄层板和自制薄层板(制备方法) 普通薄层板和高效薄层板(分离效果) 正相薄层板和反相薄层板(流动相极性) 硅胶、硅胶F254、氧化铝、纤维素、聚酰胺薄层板和C18键合相、氨基键合相、腈基键合相、二醇基键合相薄层板(固定相类型分类),2.1薄层板,2.1.2自制薄层板: 须能保证色谱质量；对薄层板需特别处理和化学改性可用；节约成本。 玻璃板要求：表面光洁、平整，厚1-2mm，洁净。 规格：10cm×10cm、10 cm×15cm、10 cm×20cm、20 cm×20cm,2.1薄层板,最常用固定相：硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254；氧化铝；硅澡土；纤维素；聚酰胺等。 吸附剂直径10-40m 黏合剂：10%-15%煅石膏、0.2%-0.5%羧甲基纤维素钠、淀粉、有机高分子聚合 物、特殊要求可用缓冲液、稀碱液等。,2.2点样器,毛细管 微量注射器 半自动及全自动点样器,2.3展开容器,专用平底或双槽展开缸、盖能密闭 特殊水平展开缸,2.4显色设备,喷雾显色：玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，用压缩气体可使试剂呈均匀细雾状喷出 浸渍显色 蒸气熏蒸显色,2.5色谱检视装置,可见紫外三用仪 装置可见紫外光源及相应滤光片的暗箱 拍摄图像的设备,3.操作方法,3.1薄层板制备 自制方法：硅胶：1份固定相加3份水-研磨混合-涂布-晾干-活化-备用；纤维素：与水1：5或6；聚酰胺：与水1：4，或与甲醇1：3 薄层板活化：硅胶、氧化铝、硅澡土：110、30分钟；纤维素：105 、30分钟；聚酰胺：6080、30分钟,用涂布器制板的要点：玻璃板要清洁；调浆要均匀；涂布后的薄层板应低温缓慢干燥。 自制薄板要求：表面均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损、无污染。 薄层厚薄对Rf值影响：硅胶G板当厚低于150m时， Rf值随薄层的减低而增大，可变性大；板厚250 m ， Rf改变不显著。,薄层层析操作要点铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：23，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。,研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。,3.2点样,形状：圆点状、窄细条状 点样位置：距底边1-1.5cm、点与点以不影响检出为宜一般不少于0.8cm、圆点直径不大于0.3cm、条带宽0.5-1.0cm 高效板间距可适当缩小,点样尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。,3.3展开,以直立展开为多 展开剂用量：展开后仍留有三分之二以上体积为宜；浸入展开剂的深度以距原点0.5cm为宜； 展开距离：8-15cm 溶剂蒸气预饱和：15-30分钟,展开剂配制,选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。,混合展开剂通常不能重复使用： 低沸点物质蒸发比高沸点多 湿度变化 其中一种溶剂被优先吸附 各组分间可能发生相互作用 吸附剂中杂质不断流出引起组成改变,展开系统的饱和,一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快,温湿度的控制,温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。,3.4显色与检视,有色物：可直接日光下检视 荧光物：365nm紫外灯下观察荧光色谱 无色物：喷雾显色剂、或进行适宜处理显色 紫外吸收物：用荧光板在254nm紫外灯下观察荧光淬灭物形成色谱,由于通常用薄层色谱分析法进行定量分析的过程中，薄层扫描仪是最为重要的，因此对它进行略详的介绍。 薄层扫描仪的基本结构及主要功能基本是相同的，每台仪器都包括光源、分光器、检测器、数据处理及信号输出几个部分。,典型的检测方法是吸收检测法，其基本测定原理为，用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点或被斑点反射的光束，根据光束被斑点吸收后强度的变化来确定组分的含量。 薄层色谱法的优点特别适合我国国情，已成为许多实验室不可缺少的分离手段。该方法在科研、教学、临床、生产等各个领域中广泛应用，分离对象也无所不包。,显色剂的要求： 至少可以把微克级的被分离物质显示出来； 能给出一个确定的显示区域； 显示区域有一定的稳定 性。,显色剂可以分成两大类： 一类是检查一般有机化合物的通用显色剂； 另一类是根据化合物分类或特殊官能团设计的专属性显色剂。,常用通用显色剂： 硫酸常用的有四种溶液：硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5molL硫酸溶液与0.5-1.5molL硫酸铵溶液，喷后110oC烤15min，不同有机化合物显不同颜色。,常用通用显色剂： 0.5碘的氯仿溶液 对很多化合物显黄棕色。 中性0.05高锰酸钾溶液 易还原性化合物在淡红背景上显黄色。,常用通用显色剂：,碱性高锰酸钾试剂 还原性化合物在淡红色背景上显黄色。 溶液I：1高锰酸钾溶液；溶液：5碳酸钠溶液；溶液I和溶液等量混合应用。,常用通用显色剂：,酸性高锰酸钾试剂 喷1.6高锰酸钾浓硫酸溶液(溶解时注意防止爆炸)，喷后薄层于180oC加热1520min。,常用通用显色剂：,酸性重铬酸钾试剂 喷5重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150oC烤薄层。 5磷钼酸乙醇溶液 喷后120oC烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。 铁氰化钾-三氯化铁试剂 还原性物质显蓝色，再喷2molL盐酸溶液，则蓝色加深。 溶液I：1铁氰化钾溶液；溶液：2三氯化铁溶液；临用前将溶液I和溶液等量混合。,专属性显色剂 由于化合物种类繁多，因此专属性显色剂也是很多的，现将在各类化合物中最常用的显色剂列举如下：,烃类 硝酸银过氧化氢 检出物：卤代烃类。 溶液：硝酸银O.1g溶于水lml，加2-苯氧基乙醇lOOml，用丙酮稀释至200ml，再加30过氧化氢1滴。 方法：喷后置未过滤的紫外光下照射； 结果：斑点呈暗黑色。,荧光素溴 检出物：不饱和烃。 溶液：I荧光素0.1g溶于乙醇lOOml；5溴的四氯化碳溶液。 方法：先喷(I)，然后置含溴蒸气容器内，荧光素转变为四溴荧光素(曙红)，荧光消失，不饱和烃斑点由于溴的加成，阻止生成曙红而保留荧光，多数不饱和烃在粉红色背景上呈黄色。,四氯邻苯二甲酸酐 检出物：芳香烃。 溶液：2四氯邻苯二甲酸酐的丙酮与氯代苯(10：1)的溶液。 方法：喷后置紫外光下观察。,甲醛硫酸 检出物：多环芳烃。 溶液：37甲醛溶液O.2ml溶于浓硫酸l0ml。,(2)醇类 3，5一二硝基苯酰氯 检出物：醇类。 溶液：I2本品甲苯溶液；0.5氢氧化钠溶液；O.002罗丹明溶液。 方法：先喷(I)，在空气中干燥过夜，用蒸气薰2min，将纸或薄层通过试液()30s，喷水洗，趁湿通过()15s，空气干燥，紫外灯下观察。,硝酸铈铵 检出物：醇类。 溶液：I1硝酸铈铵的0.2molL硝酸溶液；N,N-二甲基-对苯二胺盐酸盐1.5g溶于甲醇、水与乙酸(128m1+25m1+15m1)混合液中，用前将(I)与()等量混合。喷板后于105oC加热5min。,香草醛硫酸 检出物：高级醇、酚、甾类及精油。 溶液：香草醛1g溶于硫酸lOOml。 方法：喷后于120oC加热至呈色最深。,二苯基苦基偕肼 检出物：醇类、萜烯、羰基、酯与醚类。 溶液：本品15mg溶于氯仿25ml中。 方法：喷后于110oC加热5lOmin。 结果：紫色背景呈黄色斑点。,(3)醛酮类 品红亚硫酸 检出物：醛基化合物。 溶液：I0.01%品红溶液，通入二氧化硫直至无色；0.05molL氯化汞溶液； O.05molL硫酸溶液。 方法：将I、以1：1：10混合，用水稀释至l00ml。,邻联茴香胺 检出物：醛类、酮类。 溶液：本品乙酸饱和溶液。,2，4-二硝基苯肼 检出物：醛基、酮基及酮糖。 溶液：I0.4本品的2molL盐酸溶液； 本品O.1g溶于乙醇l00ml中，加浓盐酸lml。 方法：喷溶液I或后，立即喷铁氰化钾的2molL盐酸溶液。 结果