DNA凝胶回收
10/09 Ver.1 爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: technicalaxygen.com.cn www.axygen.com.cn Page 1 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒凝胶回收试剂盒 本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至 8 g DNA（70bp-10Kb） ，回收率为 60-85%。琼脂糖凝 胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中熔化，其中的保护剂能防止线状 DNA 在高温下降解，然后在 DE-B 溶液 的作用下使 DNA 选择性结合到膜上。纯化的 DNA 纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于 连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 一、试剂盒组成、贮存、稳定性一、试剂盒组成、贮存、稳定性 Cat. No. AP-GX-4 AP-GX-50 AP-GX-250 制备次数 4 preps 50 preps 250 preps 制备管 4 50 250 2 ml 离心管 4 50 250 1.5 ml 离心管 4 50 250 Buffer DE-A 6 ml 2×33 ml 2×165 ml Buffer DE-B 3 ml 33 ml 165 ml Buffer W1 2.8 ml 28 ml 135 ml Buffer W2 concentrate 2.4 ml 24 ml 2×72 ml Eluent 1 ml 5 ml 25 ml 说明书 1 1 1 Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含 DNA 保护剂，防止 DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。 Buffer DE-B：结合液（促使大于 70bp 的 DNA 片段选择性结合到 DNA 制备膜上） 。室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate： 去盐液， 使用前， 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 （用 100%乙醇或 95% 乙醇） ，混合均匀，室温密闭贮存。 Eluent：洗脱液，室温密闭贮存。 二、注意事项二、注意事项 1. Buffer DE-A(含有-巯基乙醇)、Buffer DE-B 和 Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套 和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水 或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。 2. 在步骤 1 中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型 DNA 长时间暴露在高温条件 下易于水解） ， 从而提高回收率。 勿将含 DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下， 减少紫外线对 DNA 造成的损伤。 10/09 Ver.1 爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: technicalaxygen.com.cn www.axygen.com.cn Page 2 3. 在步骤 2 中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响 DNA 回收率。 4. 将 Eluent 或去离子水加热至 65°C，有利于提高洗脱效率。 5. DNA 分子呈酸性，建议在 2.5 mM Tris-HCl，pH 7.0-8.5 洗脱液中保存。 三、实验准备三、实验准备 1. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。 2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。 3. 准备75°C水浴。 4. 使用前，检查Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70°C温浴加热熔化并冷却至室温后再 使用。 四、操作步骤四、操作步骤 1. 在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提 前记录 1.5 ml 离心管重量） ，该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg=100 l 体积） 。 2. 加入 3 个凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75°C 加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40°C 加热） ，间 断混合（每 2-3 min） ，直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min） 。 * Buffer DE-A 为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。 3. 加 0.5 个 Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B，混合均匀。当分离的 DNA 片段小于 400bp 时，需再加 入 1 个凝胶体积的异丙醇。 * 加 Buffer DE-B 后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。 步骤步骤 4-6 可以选择负压法或离心法。可以选择负压法或离心法。 A. 负压法负压法 4A. 正确连接负压装置，将 DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤 3 中的混合液，转移到 制备管中，开启并调节负压至-25-30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 5A. 加 500 l Buffer W1，吸尽管中溶液。 6A. 加 700 l Buffer W2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用 700 l Buffer W2 洗涤一次。 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。 7A. 将制备管置于 2 ml 离心管（试剂盒提供）中，12,000×g 离心 1 min。 10/09 Ver.1 爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: technicalaxygen.com.cn www.axygen.com.cn Page 3 B. 离心法离心法 4B. 吸取步骤 3 中的混合液，转移到 DNA 制备管（置于 2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g 离心 1 min。弃滤液。 5B. 将制备管置回 2 ml 离心管，加 500 l Buffer W1，12,000×g 离心 30 s，弃滤液。 6B. 将制备管置回 2 ml 离心管，加 700 l Buffer W2，12,000×g 离心 30 s，弃滤液。以同样的方法 再用 700 l Buffer W2 洗涤一次 12,000×g 离心 1 min。 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。 7B. 将制备管置回 2 ml 离心管中，12,000×g 离心 1 min。 8. 将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加 25-30 l Eluent 或去离子 水，室温静置 1 min。12,000×g 离心 1 min 洗脱 DNA。 * 将 Eluent 或去离子水加热至 65将提高洗脱效率。 五、流程图五、流程图 计算凝胶体积 加 3 倍凝胶体积 Buffer DE-A， 温浴 75°C 熔 化凝胶 加含 0.5 个 Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B 加 500 l Buffer W1 加 700 l Buffer W2 加 700 l Buffer W2 加 25-30 l Eluent 或去离子水 含有目的 DNA 凝胶 熔化 结合 洗涤 洗脱 10/09 Ver.1 爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: technicalaxygen.com.cn www.axygen.com.cn Page 4 六、常见问题分析六、常见问题分析 主要问题主要问题 原因原因 建议建议 1) 琼脂糖凝胶未完全熔化时目 的片段只有部分结合到膜 上，导致其余的片段在后续 洗涤过程中丢失以及出现制 备管堵塞现象，最终影响回 收效率。 在切胶时尽可能去除不含目的片段的琼脂糖，确保 buffer DE-A 的正确用量。在熔胶过程中要仔细检查 确保无固体琼脂糖残留， 间隔性的对样品进行摇晃促 进凝胶的充分熔化。 2) 小于 400bp 的片段未加异 丙醇 务必确保已加入 1 倍凝胶体积的异丙醇（100%） 。 1. 目的片段结 合量低 目的片段结 合量低 3) 电泳缓冲液 pH 值过高，影 响目的片段的结合 建议加入 10l 3M NaAC 中和。 2. 结合的结合的 DNA 片段过早的被 洗脱 片段过早的被 洗脱 Buffer W2 中未加无水乙醇 或者乙醇浓度不是 95 - 100%的 确保加入正确的乙醇量。每次使用后应拧紧瓶盖，以 免乙醇挥发，降低回收率。 回收率低回收率低 3. 洗脱效率低洗脱效率低 最后一次Buffer W2洗涤完后不要将制备管放于负压 装置上抽得过干。 洗脱液或者去离子水 65°C 预热以及增加洗脱前静置 时间至 5min，都可提高洗脱效率。 选用合适浓度的琼脂糖凝胶电泳， 上样量不超过制备 管的最大结合量（8g） 。 后 续 酶 促 反 应不理想 后 续 酶 促 反 应不理想 1. 盐污染 2. 乙醇污染 3. 琼脂糖残留 4. 洗脱产物中含有 ssDNA 确保用 Buffer W2 洗涤 2 次。 在最后一次Buffer W2洗涤后可将制备管离心时间由 原来 1min 增加至 2min。 切胶时尽可能去除不含有 DNA 片段部分的凝胶以便 于对琼脂糖的处理，确保琼脂糖块在 Buffer DE-A 中 完全熔化。 将洗脱产物 95加热 2min，慢慢冷却至室温，使单 链 DNA 重新退火即可。
