自噬在肝内胆管癌发生发展中作用及其临床预后相关性分析

第二军医大学 硕士学位论文 自噬在肝内胆管癌发生发展中的作用及其临床预后相关性分析 姓名：侯玉杰 申请学位级别：硕士 专业：肿瘤学 指导教师：王红阳 20100501 自噬祈；肝内胆管癌发生发腱中的作用及J C , l ' a i 床顶后相关性分析 摘要 肝内胆管癌I C C ( I n t r a h e p a t i cc h o l a n g i o c a r c i n o m a ) 约占原位肝癌发生率的1 0 ， 近年来已经上升为肝内原发肿瘤导致死亡的第一位。目前认为，肝内胆管癌发生与胆 管结石、H B V H C V 感染以及一些其他胆管炎症等因素有关。I C C 发病较隐匿，临床 症状不典型，较难早期诊断，大部分肝内胆管癌发现时已是晚期，无法手术治疗。即 使早期发现手术治疗的，其五年生存率 5 0 的细胞存活，而正常非转化的成纤维细胞系在同样 条件下只能存活l 天【2 5 1 。K a z u n o r iS a t o 等人的研究已经证实在结肠癌中自噬是处于高 水平激活状态的，而且自噬的标志分子L C 3 I I 在人结肠癌组织中也是高表达的，并 且在饥饿条件下抑制自噬能够促进细胞的凋亡【2 6 1 。另一方面，许多生化应激可以诱 导凋亡1 27 。，而在许多肿瘤中凋亡分子却因为各种抗凋亡通路和分子的激活被抑制， 虽然凋亡分子被抑制，但自噬仍然保持高度活化状态。在营养剥夺条件下，不管应用 抑制剂间接抑制自噬还是使自噬相关基因b e c l i n l 或a t 9 5 等失活，都能阻碍细胞的生 长，即使在凋亡被抑制的情况下2 8 3 ¨。 众所周知，胆管癌是低营养、低血供的恶性肿瘤，而对于其在外部营养供应不 充分的情况下如何获取能量以维持细胞恶性增殖又知之甚少，我们想到自噬是否会在 其中发挥了作用? 于是，设计实验探索了肝内胆管癌中自噬的表达情况，对其功能做 了初步的研究和探讨，并结合临床病理资料探讨了B e c l i n l 蛋白的表达与肝内胆管癌 发生发展的关系，为进一步研究自噬在胆管癌发生发展中的作用和寻找胆管癌治疗相 关的预后分子提供实验和理论依据。 自噬在肝内月【 管痛发生发展中的作用及其临床预后相关性分析 1 主要化学药品和生物试剂 试剂和仪器 1 1 普通试剂：氯化钠、盐酸、冰乙酸、甲醇、无水乙醇和异丙醇：上海试剂一厂； T r i s 碱、十二烷基磺酸钠和B - 焦磷酸甘油：S i g m a 公司；琼脂糖、琼脂：G I B C O B R L 公司；溴酚蓝( B r o m o p h e n o lb l u e ) 、溴化乙锭( E t h i d i u mb r o m i d e ) 、蛋白 胨及酵母提取物：O X O I D 公司；牛血清白蛋白( B S A ) ：上海华舜公司；各种 限制性内切酶、T 4D N A 连接酶及T a q 酶：M B I 公司。 1 2 免疫组化所需的主要试剂：无水乙醇、9 5 乙醇、7 5 乙醇、二甲苯和甲醇： 上海振兴化工一厂；牛血清白蛋白：上海博光生物科技有限公司；D a k oE n v i s i o n 免疫组织化学试剂盒：D a k oR e a g e n tC o ，D e n m a r k ；柠檬酸、柠檬酸三钠：上海 试剂一厂；磷酸氢二钠：临平化工试剂厂；磷酸二氢钠、氯化钠：上海生化试剂 一厂；抗B e c l i n l 一抗：S a n t aC r u z 公司，1 ：4 0 稀释；去离子水：本室自制；3 0 过氧化氢：北京中山生物技术有限公司；二抗：羊抗兔多克隆抗体，即用型： D a k o 试剂公司；液体D A B 酶底物显色试剂盒：上海长岛生物技术有限公司；中 性树脂：上海标本模型厂。 1 3W e s t e r nb l o t 所需的主要试剂：E C L 化学发光检测系统：S a n t aC r u z 公司； 抗B e c l i n l 一抗：S a n t aC r u z 公司；抗L C 3 I I 一抗：A b c a m 公司；抗G A P D H 一抗：康成生物科技有限公司；抗T u b l i n 一抗：C e l lS i g n a lT e c h n o l o g y 公司；抗 鼠及抗兔二抗：上海华舜公司；B C Ap r o t e i na s s a yk i t ( 蛋白定量试剂盒) ： P i e r c e 公司；3 M 滤纸：W h a t m a n 公司；X F i l m ：K a d a 公司；硝酸纤维素 膜( N C 膜) ：S & S 公司；叠氮钠：S i g m a 公司。 1 4 细胞生物学实验所需的主要试剂：D u l b e c c o Sm o d i f i e dE a g l em e d i u m ( D M E M ) 和R P M IM e d i u m1 6 4 0 ：G I B C OB R L 公司：E a r l e SB a l a n c e dS a l t S o l u t i o n ：S i g m a A l d r i c h 公司；胰蛋白酶：G I B C OB R L 公司；小牛及胎牛 血清( N C S F B S ) ：G I B C OB R L 公司；3 - m e t h y l a d e n i n e ：S i g m a 公司： W o r t m a n n i n ：S i g m a 公司。 第二军医大学硕士学位论文 1 5 质粒和细胞系：质粒G F P L C 3 由中科院细胞生化所赵穆钧教授提供； Q B C 9 3 9 、R B E 、H C C C 9 8 1 0 细胞均为本室保存。 1 6 试剂盒：A n n e x i nV F I T C 细胞凋亡检测试剂盒购自I n v i t r o g e n 公司：转染试剂 F u G E N E R H DT r a n s f e c t i o nR e a g e n t ：R o c h e 公司。 2 主要溶液的配制( 主要参照分子实验克隆指南，第二版) 2 11 0 MT r i s H C ! 缓冲液的配制 a p H 6 8 ：称取1 2 1 2 9T r i s 碱，加入8 0 0 m l 去离子水，磁力搅拌下完全溶解，用约 1 1 5 m l1 0 0 M 浓盐酸调节p H 值至6 8 ，去离子水定容至1 0 0 0 m l ，室温保存备用； b p H 7 5 ：称取1 2 1 2 9T r i s 碱，加入8 0 0 m l 去离子水，磁力搅拌下完全溶解，用约 8 0 6 m l1 0 M 浓盐酸调节p H 值至7 5 ，去离子水定容至1 0 0 0m l ，室温保存备用； c p H 8 0 ：称取1 2 1 2 9T r i s 碱，加入8 0 0 m l 去离子水，磁力搅拌下完全溶解，用 约5 8 4 m l1 0 M 浓盐酸调节p H 值至8 0 ，去离子水定容至1 0 0 0 m l ，室温保存备 用： d p H 8 8 ：称取1 2 1 2 9T r i s 碱，加入8 0 0 m l 去离子水，磁力搅拌下完全溶解，用 约1 7 m l1 0 M 浓盐酸调节p H 值至8 8 ，去离子水定容至1 0 0 0 m l ，室温保存备用。 2 2T E ( 1 0 0 m 1 ) 0 1 2 1 l gT r i s 碱( 1 0 m M ) ，0 0 3 7 2 2 9E D T A ( 1 m M ) ，用8 0 m lD E P C 处理的去离子水充分溶解，加数滴浓H C I 调节p H 值至8 0 ，并将体积调节至 1 0 0 m l ，4 “ C 保存。 2 33 Ms o d i u ma c e t a t e ( p H 5 2 ) 5 0 4 9N a A c 溶于8 0 m lD E P C 处理的去离子水中， 用冰醋酸调节p H 值至5 2 ，然后定容至2 0 0 m l 。高压灭菌后室温备用。 2 41 0 S D S ( 十二烷基磺酸钠) 1 0 9S D S 在6 8 。C 的条件下溶解于9 0 m l 去离子水 中，加数滴浓盐酸调节p H 值至7 2 ，冷却后去离子水定容至1 0 0 m l ，室温保存。 2 5 三去污剂裂解液1 5 0 r a MN a C l ，5 0 m MT r i s C 1 ，p H8 0 ，1 N P 4 0 ，0 5 D O C ，O 1 S D S ，l m MN a 3 V 0 4 ，l m MN a F 。临用前加l m MD T T ，1 t t g m l a p r o t i n i n ，0 5 m MP M S F 。 2 62 ×S D S P A G El o a d i n gb u f f e r ( L a e m m l ib u d 10 0 m MT r i s C lp H6 8 ， 2 0 0 m MD T T ，4 S D S ，O 2 溴酚兰，2 0 g l y c e r o l ，一8 0 。C 保存。 1 0 自噬在肝内月L 管痛发生发展中的作用及其临床预后相关性分析 2 75 ×T r i s G l y 在9 0 0 m l 去离子水中溶解1 5 1 9 瞄s 碱和9 4 9 甘氨酸，然后加入 5 0 m l1 0 ( w v ) 的电泳级S D S 储存液，用去离子水补至1 0 0 0 m l ，则成5 x T r i s O l y 储存液，室温密闭保存。 2 81 0 XT B S T8 0 9 N a C l ，2 4 2 9T r i s 碱，用8 0 0 m l 的去离子水溶解，调节p H 值至 7 6 ，加l m lT w e e n 2 0 ，定容至1 0 0 0 m l 。室温保存备用，用前1 0 倍稀释。 2 9W e s t e r nb l o t 电转移缓冲液( 1 L ) 3 9 m M 甘氨酸，4 8 m MT r i s 碱，0 0 3 7 S D S ， 2 0 甲醇。配制l L 转移缓冲液，称取2 9 9 甘氨酸，5 8 9T r i s 碱，0 3 7 9S D S ， 并加入2 0 0 m l 甲醇，加水至总量为l L 。 2 1 01 0XP o n e e a uS s t a i n i n gs o l u t i o n2 9P o n e e a uS ( 丽春红S ) ，3 0 9T C A ( 三氯醋 酸) ，3 0 9 磺基水杨酸，加适量的水充分溶解，定容至1 0 0 m l 。 2 1 1N C 膜B l o c k i n gb u f f e r ( 封闭液) 5 脱脂奶粉，O 1 T w e e n 一2 0 ，用l x T B S 溶解。 2 1 20 0 1 MP B S ( P H 7 4 ) - 氯化钠9 9 ，磷酸氢二钠·1 2 H 2 04 9 ，磷酸二氢钠0 2 H 2 00 4 9 ， 蒸馏水1 0 0 0 m l 。 2 1 30 0 1 M 枸橼酸盐缓冲液：柠檬酸三钠3 9 ，柠檬酸O 4 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 2 1 41 B S A 封闭液：1 0 m gB S A ，0 0 1 MP B Sl m l 。 3 其他试剂配制 3 13M A 溶液：5 0 0 m g3 - M A ，1 6 7 5 m l 无菌水。配成终浓度为4 0 0 m M 的贮存液， 分装，2 0 度保存；使用前7 0 8 0 度水浴