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浅析类风湿性关节炎rf阳性与阴性患者外周血cd4+细胞基因表达的差异

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浅析类风湿性关节炎rf阳性与阴性患者外周血cd4+细胞基因表达的差异

从本学科出发,应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性,便于研究生提出新见解,特别是博士生必须有创新性的成果浅析类风湿性关节炎RF阳性与阴性患者外周血CD4+细胞基因表达的差异 【摘要】 目的: 研究RF因子阳性及阴性RA患者之间是否存在基因组学的差异, 探询差异存在的基因表达基础。方法: 应用基因表达谱方法来检测上述两型患者CD4+淋巴细胞基因表达情况。结果: RF因子阳性与阴性患者之间有55条基因表达差异有统计学意义。结论: RF因子阳性与阴性RA患者之间存在差异表达基因, 这些差异基因多与免疫应答相关。 【关键词】 类风湿性关节炎 类风湿因子 基因表达 类风湿性关节炎是以周围关节对称性炎症为主、 伴反复发作的慢性全身性疾病, 患者中关节局部致残率高达60%以上, 是一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病, 其病因目前尚不十分明确, 主要与遗传、 感染、 激素、 免疫因素等相关1。近期研究表明: RA的发生发展与CD4淋巴细胞改变关系密切, 关节滑膜中浸润的CD4+T淋巴细胞对自身抗原产生特异性免疫应答, 促进单核巨噬细胞的活化核细胞毒性T细胞的分化, 导致炎症细胞因子释放, 形成炎性损伤。类风湿因子是临床诊断和治疗RA过程中最常用的检测项目之一, 它在RA中的阳性率约为60%80%, 但特异性低2,。为了探询RA中RF阴性与阳性患者之间是否存在基因表达差异, 我们利用基因芯片技术对RA患者外周血CD4+细胞进行了检测与研究。 1 对象和方法 对象 RA患者33例来自北京中日友好医院风湿病科及中国中医科学院西苑医院风湿病科, 均为女性患者, 年龄2160岁, 平均岁, 病程210年, 平均年; 其中RF+患者22例, 年龄2160岁, 平均岁, 病程210年, 平均年; RF-患者11例, 年龄3460岁, 平均岁, 病程28年, 平均年。疾病诊断参照1987年美国风湿病学会修订的诊断标准4, 病例排除标准包括: 合并严重关节外表现, 如高热不退、 多发类风湿结节、 肺间质纤维化、 肾脏淀粉样变、 缩窄性心包炎、 血管炎等需要使用糖皮质激素的患者; 虽为本病患者, 但长期服用有关治疗RA的慢作用药物, 且在本研究前至少1周内未停用甲氨喋呤、 氯喹、 柳氮磺胺吡啶、 环磷酰胺、 青霉胺和金制剂等免疫抑制类药物的患者; 合并有循环、 呼吸、 消化、 泌尿生殖、 造血系统以及中枢神经系统等严重疾病的患者; 精神病患者; 孕妇或哺乳期女性的患者; 过往用药记录不明确者。另选中国中医科学院西苑医院体检中心12名体检者作为对照, 对照组为正常体检人群, 经体检后其心电图、 血脂、 血糖及肝功能均无异常。所有纳入者均采集晨起空腹静脉血6mL, 肝素抗凝备用。 方法 CD4+T淋巴细胞分离纯化 采集的静脉血, 以体积比为50 L/1 mL血液的比例, 将CD4+ enrichment抗体加入血液中混匀, 室温下放置20 min。含胎牛血清的PBS等量稀释样本, 轻轻混匀, 将混合液体小心加到Ficoll密度介质上, 形成分界面, 室温下1200 g速度离心20 min。用一次性吸量管在密度介质层与血浆层之间收集淋巴细胞, PBS清洗, 冰氯化铵溶解残存红细胞, PBS清洗2遍, 即可得到纯度90%以上的CD4+T淋巴细胞。 RNA提取及鉴定 按TRIzol说明书, 提取细胞总RNA, 并进行RNA鉴定, 其A260/A280比值必须不低于。aRNA制备: 根据MessageAmp aRNA试剂盒操作说明进行。用TOligo(dT)逆转录合成第1条cDNA链, 以第1条cDNA链为模板合成第2条cDNA链, cDNA链纯化, 体外转录合成aRNA, aRNA纯化, aRNA鉴定及含量测定。 标记的aRNA探针与基因表达芯片杂交及检测 芯片由University of British Columbia、 Canada提供, 为全基因组序列, 共23232个点, 设有空白对照、 阴性对照、 管家基因对照。根据PerkinElmer Micromax ASAP RNA labeling试剂盒操作说明进行。所有芯片均以相同对照标记为Cy3, 样本标记为Cy5。 基因芯片图像扫描 用GenePix000B scanner进行图像扫描。 数据的分析 包括图像的分析、 标准化处理、 ratio值分析、 基因的聚类分析。利用genepix100分析软件, 对扫描的图像进行图像数据的转换。所得数据, 根据芯片数据剔除的基本法则, 剔除一些不可靠基因点值, 包括剔除荧光值溢出点, 荧光前景值低于倍背景中位数值的基因点, 然后根据转换数据中的SNR, 剔除SNR或者 2 结果 .1 RF+与RF-患者基因表达差异 RF+与RF-患者之间有55条基因表达差异具有明显性, 其中上调基因有40条, 下调基因有15条, 这些差异表达基因主要涉及免疫应答基因, 如TNF受体超家族基因、 热休克蛋白基因、 天冬氨酰tRNA合成酶、 干扰素、 T细胞受体介导分子、 STAT诱导的STAT抑制因子、 干扰素诱生蛋白等。 RF-患者与对照组的表达差异 RF+、 RF-患者与对照组之间有42条基因差异表达, 这些差异表达基因主要与成纤维细胞生长因子8、 钙调热稳定蛋白、 锌指蛋白264、 信号识别蛋白、 蛋白激酶NYDSP15等相关。 表2 RF+、 RF-患者与对照组之间部分差异表达基因 Tab Defferential expression genes among group 3 讨论 RA是以对称性多关节炎为主要临床表现的系统性自身免疫紊乱疾病, 病程呈慢性、 进行性、 破坏性进展。其发病机制目前尚不明确, 众多研究表明RA的发生发展涉及多种基因的异常变化, 研究RA相关的基因和蛋白变化, 对于疾病的诊断、 分类、 治疗都具有重要的意义。既往文献研究表明: CD4+T淋巴细胞是自身免疫中的重要反应细胞, 在RA发病中有重要作用5, RA患者T细胞亚群中CD4+T淋巴细胞比例及克隆扩增能力均有所改变7,。因此选取RA患者外周血CD4+T淋巴细胞作为研究的对象进行观察。基因芯片技术经过10余年的发展已日益成熟, 它能够高通量、 高效率、 低能耗的对生物学信息进行分析处理, 它能够在1次实验中筛选出疾病的大量相关基因群, 检出疾病发生发展的决定基因。基于如此优点的考虑, 我们引入基因芯片技术对RA的发病机制从基因水平进行研究和探讨。 RF异常变化是RA免疫功能异常的重要表现, 也是诊断和估计RA愈后的常用参考指标。通常所说的RF是指采用乳胶凝集试验测得的IgMRF, 但其在RA患者阳性率为60%80%, 特异性较差9, 10。在芯片检测中发现RF+与RF-患者之间有55条基因表达具有显著性差异, 提示RF+与RF-患者之间确实存在基因组水平的差异表达。这些差异的基因涉及核苷酸糖、 氨基糖、 天冬氨酸等物质的代谢途径, 以及细胞因子受体、 信号传导等多种生物学途径。对这些基因的功能检索发现它们参与了细胞生长、 生理过程、 分子结合、 催化信号转导等过程。而由表2发现: 与对照组健康人比较表达基因主要涉及有机酸代谢、 酶类活性调控、 生长过程调节、 细胞增殖抑制、 跨膜离子转运以及部分特定酶活性调节等。将表1与表2中差异基因进行比对, 发现只有4个差异基因表达是相同的, 这个结果反映了RA患者同正常对照之间及RA患者不同RF型之间的基因差异表达, 存在各自的基因表达谱基础。 利用基因芯片技术和生物信息学技术分析基因在全局、 系统水平的调控机制是当前功能基因组学的重要研究手段, 它明显优于过去的单一基因研究模式, 可以在整体基因组的水平对基因的表达调控网络机制, 进行系统全面的分析11。临床的RA患者中表现为不同RF型很常见, 但是相关的基础研究却不多见。此次的实验结果从基因组学的角度反映出不同RF型RA患者之间存在基因表达谱的差异, 而差异基因主要与免疫应答过程相关, 今后可以围绕具体的差异表达基因进行分析, 找出两型患者的特征基因, 从而提高RF对RA临床诊断的特异性, 具有一定的临床意义。 【参考文献】 1 姜良勇. 类风湿性关节炎发病的免疫学机制J. 细胞与分子免疫学杂志, 1998, 14(3):33-235. 2 吴庆军, 曾小峰, 唐福林, 等. 类风湿关节炎早期诊断的血清学研究和临床应用J. 医学研究杂志,006,5(5):3-44.3 卿之驹, 秦立新, 蒋洪敏. 检测类风湿因子IgMRF、 IgGRF、 IgARF在类风湿关节炎中的临床意义J. 中国现代医学杂志,004, 14(14): 117-119.4 Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. American rheumatism association 198revised criteria for the classification of rheumatoid arthritisJ. Arthr Rheum, 1988,1(3):15-324.5 Wagner U, SchulzeKoops H. T cellsdo they control rheumatic immune responses?J. Z Rheumaol,005,4(6):77-382.6 Toubi E, Kessel A, Mahmudov Z, et al. Increased spontaneous apoptosis of CD4+CD25+ T cells in patients with active rheumatoid arthritis is reduced by infliximabJ. Ann N Y Acad Sci,005, 1051:06-514.7 Hussey RE, Richardson NE, Kowalski M, et al. A soluble CDprotEin selectively inhibits HIV replication and syncytium formationJ. Nature, 1988,31(6151):8-81.8 Moldovan MC, Yachou A, Levesque K, et al. CDdimers constitute the functional component required for T cell activationJ. J Immunol,002, 169(11):261-6268.9 郭明阳, 周厚永, 张明友. 类风湿因子阳性意义评价J. 西南军医,004,(4):9-50.10 蔡文虹, 孙保东, 洪小平. RF、 CCP和AKA联合检测在类风湿关节炎诊断中的评价J. 临床和实验医学杂志,006,(6):71-673.11 Golub TR, Sonim DK, Tamayo P, et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoringJ. Science, 1999,86(5439):31-537. 课题份量和

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