汉黄芩素对移植人卵巢癌skov3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白htert影响与凋亡相关性研究_1

从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果汉黄芩素对移植人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白hTERT影响与凋亡相关性研究 【摘要】 目的评价汉黄芩素对移植人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白hTERT 影响 与凋亡相关性。 方法 移植人卵巢癌SKOV3细胞的裸鼠随机分为5组：汉黄芩素高剂量组，低剂量组，空白对照组，常规化疗组和联合用药组。采用抗生素-生物素过氧化酶复合物免疫组化法检测裸鼠组织中hTERT，Bcl-2，Bax蛋白及凋亡指数的表达。结果裸鼠组织经汉黄芩素作用后，随着汉黄芩素剂量的增大，对瘤体端粒酶hTERT蛋白表达有抑制作用，呈剂量依赖性。Bcl-2蛋白表达逐渐下调，与凋亡指数变化的表达呈相反变化趋势，而Bax蛋白表达逐渐上调，与凋亡指数变化的表达呈同向变化趋势。结论汉黄芩素在体内具有抗肿瘤和抑制端粒酶活性的作用，抑制强度与剂量成正比，下调端粒酶活性，同时也伴随细胞的凋亡，可能是药物对端粒活性的抑制和对端粒结构的破坏，启动了凋亡基因。 【关键词】 汉黄芩素 卵巢肿瘤 端粒酶 凋亡 Abstract：Objective Regulating telomerase activation is an ideal way to treat cancer . Current studies show that wogonin has the attributes of antioxidation and inhibition on the growth of tumor cells . This study aimed at evaluating the relationship between telomerase activation and apoptosis after wogonin administration in nude mice which implanted human ovarian cancer cells SKOV3. MethodsNude mice with implanted human ovarian cancer cells SKOVwere randomly divided into five groups, including high dose group ,low dose group , normal control group , cisplatin therapy group, and combined therapy group (cisplatin and wogonin) . The expression of hTERT, Bcl-2, Bax and the apoptosis index were detected by The results showed that wogonin could significantly suppress the growth of tumor compared with controlled group. The down expression of telomerase activation and the effectiveness was related to the dose of wogonin . With the increase of suppressing on tumor ,the expression of Bcl-decrease regularly , and it showed the opposite tendency of the apoptosis index . While the expression of Bax increased regularly ,and it showed the same tendency with the change of apoptosis expression. ConclusionWogonis can suppress the growth of tumor and regulate telomerase activation. The effectiveness is related to the dose of wogonin , the effect of wogonin would be better if it is combined with cisplatin in the treatment of tumor . It downregulates the activation of telomerase accompanied with apoptosis of cells ,the possible reason is that it damages the structure of telomerase and switch on apoptosis gene . Key words：Wogonin; Tumor of the ovary; Telomerase； Apoptosis 端粒酶是维持端粒长度、确保肿瘤细胞不退出细胞周期而得以永生化的关键之一。85% 的肿瘤细胞表达端粒酶活性，端粒酶的激活与肿瘤增殖密切相关，因此端粒酶成为 治疗 恶性肿瘤的一个理想的靶点。近年来寻找和 研究 端粒酶抑制剂是国内外研究的一个热点。本课题组前期研究汉黄芩素表明在体外它具有诱导卵巢癌细胞凋亡作用，能抑制端粒酶活性的表达1。本研究通过动物实验，观察汉黄芩素对肿瘤生长的抑制作用，并研究其对移植人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠组织端粒酶蛋白hTERT影响与凋亡的相关性。 1 材料 细胞人卵巢癌SKOV3细胞由广西肿瘤防治研究所提供。培养于含10%的小牛血清，100 u/ml青霉素和100 g/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，37，5%CO2培养箱中孵育培养、传代。 药物汉黄芩素是从黄芩根中分离出的一种单体，分子量为28kDa，黄色晶体，其化学性质、理化性质、光谱数据参见 文献 2。注射用顺铂，齐鲁制药有限公司生产。 裸鼠裸鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，4周龄，约20 g左右，雌性，生产许可证SCXKXX-0005。 方法 .1 动物分组及给药将对数生长期的人卵巢癌细胞SKOV3经胰酶消化后，制备成107/ml的细胞悬液，每只裸鼠腋部皮下接种，约2周后接种原位出现肿瘤，成功率为27/30。选取其中25只裸鼠随机分为5组即：汉黄芩素高剂量A组600 mg·kg-1·d-1；低剂量B组300 mg·kg-1·d-1；常规治疗C组腹腔注射顺铂mg·kg-1·d-1；联合用药D组同时用腹腔注射顺铂mg·kg-1·d-1和灌胃给药600 mg·kg-1·d-1；空白对照E组灌生理盐水10 ml·kg-1·d-1；采用灌胃给药开始治疗，共用药10 d。停药d后处死所有裸鼠，取瘤块并分成约 g/份，福尔马林固定，石蜡包埋。常规HE染色。 .2 检测裸鼠组织中hTERT，Bcl-2,Bax蛋白的表达方法采用抗生素-生物素过氧化酶复合物免疫组化法。 组织切片0.m，5烤片过夜，常规脱蜡，高压修复抗原，PBS洗涤3次。3%H2O2孵育，室温510min，H2O2要覆盖组织，PBS洗涤3次，滴加1:100的1抗，孵育1 h。PBS洗涤3次。滴加生物素标记的第2抗体，37，1015min， PBS洗涤3次。DAB显色，用中性树脂封片。 对照设置：阳性对照片染色步骤同上述；阴性对照片用PBS代替一抗；其余步骤同上。 .3 检测裸鼠组织中凋亡指数表达(TUNEL法)组织切片，常规脱蜡，20g/ml的蛋白酶K室温下消化20 min，PBS洗min×3次。3%H2O2甲醇液阻断内源性过氧化物酶20 min。PBS洗min×3次。3%牛血清白蛋白阻断20 min， PBS洗涤，TUNEL反应液，60 min，PBS洗3次，加入转换液，37，30 min。PBS洗涤3次。DAB显色，3min，苏木素染1020 min，电吹风吹干，中性树脂封片。 对照设置：阳性照片为加TUNEL反应液前用DNA酶消化30min，阴性对照片不加TUNEL反应液中的TdT，其余步骤同上。 .4 免疫组化判断 . 对照染色每批染色的阳性对照片应显示为阳性，阴性对照片应显示为阴性，否则整批片重染。 . 免疫组化染色阳性判断标准hTERT蛋白阳性反应位于胞浆和胞核中表达；Bcl-2，Bax蛋白阳性反应位于胞浆内表达，呈棕褐色或棕黄色。 . 免疫组化染色分级在全片上、下、左、右、中各随机选取一个400倍视野，观察每个视野中阳性细胞的染色强度及该强度细胞占视野中所有癌细胞的百分率。 分级：按阳性细胞占总细胞数的百分率分4级，I级：5%25%；II级：26%50%；III级：51%75%；IV级：75%。5%作为阳性标准， 一个视野的免疫组化染色得分6=该视野中的各种染色强度与该强度阳性细胞的百分率级别的乘积之和，即染色强度为1级的阳性细胞百分率级别×1染色强度为2级的阳性细胞百分率级别×2染色强度为3级的阳性细胞百分率级别×3染色强度为4级的阳性细胞百分率级别×4。该组织的免疫组化染色综合得分=5个视野的免疫组化染色得分之总和÷5。 . 细胞凋亡判断及记数凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形、蓝黑色，染色体沿核膜形成半月状或新月状，部分核凝固成致密小圆球形。光镜下随机选取5个以上高倍视野，每个视野不少于1000个细胞，按阳性细胞占细胞总数的百分率作为凋亡指数。 .5 统计学 分析 用统计软件，数据以均数±标准差表示，两样本均数的比较用t检验。多个样本均数的比较，方差齐用q检验法，方差不齐用秩和检验；率的比较用确切概率法；相互依存关系的检验用方差分析F检验。 结果 .1 肿瘤组织病 理学 观察各组裸鼠解剖时均未见胸水、腹水；联合组瘤体最小，易剥离，血供较差，切面灰白，并有液化坏死区域。显微镜下见对照组癌细胞生长旺盛，形成癌巢，细胞形态不规则，大小不等，核大呈圆形或卵圆形，核膜增厚，核分裂相较多。药物作用后联合用药D组癌细胞呈大片坏死，结构不清，大部分癌细胞崩解，偶见残余的癌细胞，间质纤维化，角质物质增多癌组织发生退行性变化，高剂量A组、低剂量B组及常规治疗C组癌细胞变性坏死，偶见核分裂相，部分癌细胞核固缩，肿瘤退行性变较对照E组明显。各组HE染色见图1。 .2 裸鼠肿瘤组织hTERT蛋白表达hTERT蛋白阳性表达大部分在胞浆，少部分在胞核，。染色综合得分比较。各用药组与对照组比较，有统计学差异；用药组间两两比较，有统计学差异。表1 裸鼠肿瘤组织hTERT蛋白免疫组化染色综合得分 .3 裸鼠肿瘤组织Bcl-2蛋白表达Bcl-2蛋白阳性表达在胞浆，。染色综合得分比较。各用药组与对照组比较，有统计学差异；用药组间两两比较，有统计学差异。表2 裸鼠肿瘤组织Bcl-2蛋白免疫组化染色综合得分 .4 裸鼠肿瘤组织Bax蛋白表达Bax蛋白阳性表达在胞浆，。染色综合得分比较。各用药组综合得分高于对照组，有统计学差异；用药组间两两比较，有统计学差异。表3 裸鼠肿瘤组织Bax蛋白免疫组化染色综合得分 .5 裸鼠肿瘤组织凋亡指数的变化表达凋亡细胞核固缩呈圆形或椭圆形、蓝黑色，染色体沿核膜形成半月状或新月状。部分核凝固成致密小圆球形，。凋亡指数的变化，其直方图，。各用药组与对照组