国家自然基金标书-慢性肾脏病进展的机制研究

项目名称：慢性肾脏病进展的机制研究首席科学家：侯凡凡 南方医科大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：广东省科技厅一、关键科学问题及研究内容1.进展性肾脏病和肾纤维化的遗传因素及其致病机制利用已建立的人群样本，对中国常见慢性肾脏病进行全基因组关联分析（GWAS）；利用已建立的患者样本和家系样本，研究肾小球足细胞骨架蛋白基因突变/多态性及其他基因突变与各种慢性肾脏病及其进展的关联，并针对易感位点进行功能研究；利用已建立的中国患者群样本，针对天然免疫补体系统和获得性免疫淋巴细胞激活分子，探讨遗传易感基因与免疫性肾脏病发生发展的关联；研究营养因素对基因组甲基化的影响及其在慢性肾脏病进展中的作用，以揭示中国人进展性肾脏病的高危人群和危险因素。2.免疫性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其机制利用已建立的中国患者群样本，以狼疮性肾炎、ANCA相关性肾炎、抗GBM肾病为切入点，探索肾组织免疫炎症过程中关键的补体活化途径和沉积机制；研究补体调节蛋白异常对补体系统功能的影响和导致免疫性炎症的机制；研究已确定的致病自身抗体（如ANCA和抗GBM抗体）所针对的关键抗原决定簇，并寻找与抗原决定簇扩散有关的同源性蛋白或病原微生物，以揭示免疫性炎症在慢性肾脏病进展中的促进作用及其分子基础。3.代谢性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其机制借助细胞模型和模式动物，系统研究炎症对肾脏细胞胆固醇重分布、肾脏泡沫细胞形成和组织损伤的机制；研究蛋白质氧化损伤对肾细胞的病理生物学活性、作用机制及对肾脏炎症和纤维化的影响；利用已建立的样本人群，研究叶酸缺乏和Hcys血症在慢性肾脏病进展中的作用及其分子机制。以阐明脂质代谢、蛋白质代谢和氨基酸代谢紊乱在代谢性炎症及肾脏病变进展中的作用和分子基础。4.肾脏内分泌激素对肾脏损伤修复和肾纤维化的调控和机制利用髓样细胞特异性MR基因敲除小鼠，阐明髓样细胞MR在肾纤维化中的调控作用及其机制；利用VDR基因敲除小鼠，明确活性维生素D对足细胞形态、功能以及足细胞中间丝蛋白Nestin表达的调控作用；建立间质细胞特异性PGIS基因敲除小鼠，揭示COX2-PGIS-PGI2通路在肾间质纤维化中的调控作用；利用SIRT1抑制剂分析SIRT1对足细胞、髓样细胞和间质细胞由VitD/VDR、醛固酮/MR、COX2-PGIS介导的下游生物学作用的影响，明确SIRT1是否通过MR、VDR参与肾脏炎症和纤维化的调控。5.肾纤维化的细胞内信号分子及基因调控利用转基因、基因敲除等技术系统，探讨Wnt/-catenin信号通路在肾纤维化中的作用及其机制，利用化学文库筛选并鉴定特异性抑制Wnt/-catenin信号的小分子抑制物，为研发干预肾纤维化的新药提供依据；寻找并鉴定参与调控肾纤维化的、Smad3依赖的miRNAs并阐明其作用机制，探索针对关键调节基因干预肾纤维化的新途径。6.预警或评估肾纤维化的生物标志物或靶标在既往对慢性肾脏病病理生理和DNA芯片研究的基础上，结合上述研究发现的生物标志物或关键靶标，改进PCR芯片构建技术，确立最优化的检测方法；构建基于肾纤维化病理生理机制的靶向基因芯片；通过比较分析不同分期慢性肾脏病患者及健康人尿液mRNA，确立进展性肾脏病的生物标志物。应用靶向泛素化降解蛋白质技术构建与Smad3特异结合的protacs，探讨其防治肾纤维化的作用。二、预期目标（一）总体目标发现中国人群与进展性肾脏病相关的易感基因及表观遗传因素；揭示免疫性和代谢性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其分子机制；确定肾脏内分泌激素对肾脏损伤修复和肾纤维化的调控作用及其机制；阐明肾纤维化的细胞内关键信号分子及基因调控；筛选预警或评估肾纤维化的生物标志物。获得一批原创性成果；找到新的防止慢性肾脏病进展的干预途径；在肾脏病研究领域，培养一批临床和基础紧密结合、适应转化性研究的新型复合型人才。（二）五年预期目标1. 完成IgA肾病的GWAS分析；阐明肾小球足细胞骨架蛋白基因突变/多态性及其他基因突变与各种慢性肾脏病进展的关联和易感位点的致病作用；发现中国人与进展性肾脏病相关的新易感基因； 揭示天然免疫补体系统和获得性免疫淋巴细胞激活分子的遗传变异与免疫性肾脏病进展的关联；阐明Hcys血症对基因组甲基化的影响及其在慢性肾脏病进展中的作用，为中国人慢性肾脏病进展和肾纤维化的预警和风险评估提供理论依据。2. 发现与我国常见慢性肾脏病发生发展相关的主要免疫学因素；明确肾脏免疫炎症过程中补体系统活化的关键途径及其沉积机制；揭示补体调节蛋白异常对补体系统功能的影响和导致免疫性炎症的机制；找到主要致病自身抗体的关键抗原决定簇和与抗原决定簇扩散有关的同源性蛋白或病原微生物，为干预免疫性炎症、防止慢性肾脏病进展和肾纤维化提供理论依据。3. 深入认识代谢性炎症在中国人慢性肾脏病发生发展中的作用。揭示炎症对肾固有细胞胆固醇重分布、肾脏泡沫细胞形成和组织损伤的机制；阐明蛋白质氧化损伤导致肾脏炎症和纤维化的机制；明确叶酸缺乏和Hcys血症在中国人慢性肾脏病进展中的作用及其机制。为干预代谢性炎症、防止慢性肾脏疾病进展和肾纤维化提供理论依据。4. 阐明髓样细胞MR在肾脏纤维化中的作用及其机制；明确活性维生素D对足细胞功能及中间丝蛋白Nestin表达的调控及其机制；揭示COX2-PGIS- PGI2通路在肾间质纤维化中的作用；明确SIRT1是否通过MR、VDR参与肾纤维化。阐明肾脏神经激素对损伤修复和肾纤维化的调控及其机制。5. 阐明进展性肾脏病的共同致病途径肾纤维化的分子机制。探讨Wnt/-catenin信号通路在肾纤维化中的作用及其分子基础，筛选并鉴定特异性抑制Wnt/-catenin信号的小分子抑制物，为研发干预肾纤维化的新药提供依据；寻找并鉴定参与调控肾纤维化的、Smad3依赖的miRNAs并阐明其作用机制，为干预进行性肾纤维化提供理论依据。6. 根据肾纤维化机制和病理生理研究的发现，构建靶向性基因微阵列，通过高通量分析尿液中mRNA，发现新的生物标志物，为最终实现无创、动态监测肾纤维化进程奠定基础。7. 在国际学术期刊发表论文60篇以上，并在本领域排名第一和第二的学术期刊发表高水平论文若干篇；申请国内外发明专利若干项；开发相关的试剂盒，用于进展性肾脏病的早期诊断和防治。8. 为国家制定慢性肾脏病防治的卫生决策提供科学依据。9. 建立一支临床和基础紧密结合、多学科交叉的肾脏病研究队伍；推进临床和基础研究成果的双向转化。三、研究方案（一）总体学术思路 慢性肾脏病进展所致的ESRD是危害人类健康、消耗大量卫生资源的重大慢性病。慢性肾脏病进展及其进展速度既与遗传基因（内因）有关，又与环境和营养等促进因素（外因）相关，肾脏病变进展至ESRD还与个体对肾脏损伤的修复反应（内因+外因）密切相关。 中国人遗传背景和环境因素都与国外人群存在差异，慢性肾脏病的原发疾病谱也与西方国家明显不同。免疫和代谢性炎症是中国人进展性慢性肾脏病的主要始动和促进因素，由此而导致的肾脏疤痕化重塑（纤维化）是各种慢性肾脏病进展至ESRD的共同致病途径。因此，本项目的总体学术思路是：针对中国人特点和常见慢性肾脏病，利用大样本社区随访和慢性肾脏病人群样本及临床资源，揭示中国人慢性肾脏病向ESRD进展的主要遗传易感和促进因素及其交互作用；以肾纤维化为主线，通过模式动物、细胞分子生物学、基因组学、蛋白质组学、肾脏病理生理学等研究手段，揭示肾脏损伤修复和肾纤维化的调控机制，明确肾脏进行性纤维化的细胞内信号分子和基因调控；发现预警或评估慢性肾脏病进展和肾纤维化风险的新生物标志物，找到防止或延缓慢性肾脏病进展的新干预靶标，为防治慢性肾脏病和制定相关卫生决策提供科学依据。(二) 主要技术路线1.遗传因素在慢性肾脏病进展中的作用及其机制1）对中国人最常见的慢性肾脏病进行全基因组SNP检测以中国人最常见的原发性肾小球疾病-IgA肾病为研究对象。一期研究采用Illuminas Human610 芯片对IgA肾病患者（n=1,500）和正常对照人群（n=1,500）进行全基因组SNP检测，找出差异表达的SNP位点；二期验证选取前200个差异表达的SNPs位点，在另一患者群中（患者群n=2,000；对照人群n=2,000）采用Sequenoms iPLEX assay进行基因分型，验证差异表达SNP位点；结合患者的临床资料和实验室检查数据，观察差异表达的SNP与临床表型及临床结局的关联性。按上述方法对中国人常见的其他慢性肾脏病进行全基因组SNP检测。2）针对肾脏关键结构损伤的遗传关联分析利用已有的激素耐药的肾病综合症及其家系样本，采用PCR扩增外显子-直接测序法进行ACTN4基因检测，分析基因突变与表型的相关性；采用TaqMan探针法分析新发现的足细胞骨架蛋白（transgelin、Arp2、Survivin、Cytokaratin7和Vinculin）编码基因的多态性及其与肾脏病理、肾脏病变进展相关性；构建基因变异体，观察骨架蛋白基因变异对足细胞形态和功能的影响；并进一步观察骨架蛋白分子参与肾损伤的分子通路和干预的可能靶点。研究编码PKD1/2基因突变在遗传性多囊肾发病学中的作用。3）针对肾脏病关键致病途径的遗传关联分析以中国人最常见的原发或继发性慢性肾脏病为重点研究对象。例如：IgA肾病（n=2，000）、系统性红斑狼疮（n=1,000）、抗肾小球基底膜病（n=100）、ANCA相关性小血管炎（n=200），以正常人群（n=2,000）为对照；参考HapMap和GWAS数据，以补体系统和淋巴细胞异常激活作为候选致病途径；采用TaqMan探针法进行SNP基因分型，采用Real-time PCR, Paralog Ratio Test进行基因拷贝数定量；利用前期开发的相关数学模型，进行基因-基因交互分析；相应阳性结论通过病例内表型关联分析和独立人群验证；确证的遗传学结果进一步进行相应的功能验证和相关机制探讨。4）营养因素影响肾脏病进展和肾纤维化的表观遗传学机制重点研究叶酸缺乏所致同型半胱氨酸血症对DNA甲基化的影响及其与慢性肾脏病进展的关系。给予正常或慢性肾脏病模型动物富含蛋氨酸饮食诱导同型半胱氨酸血症，提取组织基因组DNA，采用MedIP的方法对甲基化DNA进行富集，运用Illumina深度测序法检测上述组织内DNA甲基化并与正常组织相比较，发现具有显著变化的甲基化位点及其调控基因；观察补充叶酸对肾脏病变发展的影响和对DNA甲基化水平及调控基因表达的影响；利用已建立的慢性肾脏病患者肾组织和血标本库，验证上述结果，并分析其与肾脏病进展的相关性。2.免疫性炎症对慢性肾脏病进展和肾纤维化的促进作用及其机制1）补体系统活化在肾脏免疫性炎症中的作用本课题以ANCA相关性肾炎、抗GBM病和狼疮性肾炎为切入点，研究与肾脏病进展相关的补体活化途径、补体调节蛋白变化及其对补体系统功能的影响。利用免疫组化和/或免疫荧光技术对抗GBM病患者肾组织中沉积的补体分子进行检测。利用激光共聚焦技术，观察补体分子C4d，MBL的共定位以及Ficolin和C4d的共定位；分析补体激活的途径及其与抗GBM病临床病理表现的关系。检测狼疮性肾炎患者血清CFH和C4BP水平；分析血清CFH和C4BP水平与狼疮性肾炎病情活动、病理类型和肾脏预后的关系。应用ELISA法检测抗mCRP自身抗体对mCRP与其结合力的影响和抗C1q自身抗体对C1q与其结合力的影响；应用表面等离子共振技术（SPR）进一步检测抗mCRP和抗C1q自身抗体对C1q与CRP、C4BP和CFH因子之间相互结合能力的影响。以mCRP和C1q作为调理分子，应用双标记流式细胞仪检测抗