发酵生理微生物的代谢生物大分子降解为小分子

第二部分 微生物的代谢,生物大分子降解为小分子 代谢中间体-丙酮酸 TCA环 发酵与呼吸 代谢中能量的释放与利用 合成代谢 次级代谢与调节 代谢控制发酵 发酵工艺基础知识,生物大分子分解,微生物发酵基质主要包括淀粉、蛋白质、纤维素、果胶、核酸、脂类等,淀粉,淀粉酶,液化型 糖化型,（a淀粉酶）,葡糖生成酶,ß淀粉酶,异淀粉酶,葡萄糖,1、,（淀粉1，4葡萄糖苷酶）,（淀粉1，6葡萄糖苷酶）,（淀粉1，4麦芽糖苷酶）,工业上常用的碳源（carbon source） 1.谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉） 应用最广。 使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。,缺点：a.难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的-淀粉酶。b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。,2. 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。 工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标。,DE值：dextrose equivalent value（葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（） DE值 100干物质含量（）,淀粉水解糖的制备方法及原理 （一）酸解法（acid hydrolysis method）以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。,1.水解过程： 总反应式： (C6H10O5)n+nH2O nC6H12O6 过程：(C6H10O5)n (C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖H+对作用点无选择性，-1,4-糖苷键和-1,6-糖苷键均被切断。,评价 优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。 缺点： （1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90左右。 （2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。,淀粉葡萄糖复合二糖 5羟甲基糠醛复合低聚糖 有机酸、有色物质损失葡萄糖量 7 <1,复合反应,分解反应,盐酸,酶解法（enzyme hydrolysis method）用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。,分两步： （1）液化：用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精 和低聚糖转化为葡萄糖。所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法(double enzyme hydrolysis method)。,液化（liquification）淀粉酶水解底物内部的1,4糖苷键，不能水解1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。8590度 。,液化程度的控制（液化后需糖化的原因） 糖液的DE值低（-淀粉酶不能水解-1,6糖苷键） 液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，使糖化酶难以利用。 糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范围。,根据生产经验，DE值在2030之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。,2. 糖化（saccharification）糖化酶从非还原性末端水解-1,4糖苷键和-1,6糖苷键。 终点确定：DE值达最高时，停止酶反应。,3.评价优点： （1）反应条件温和，不需高温、高压设备。 （2）副反应少，水解糖液纯度高。 （3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。 （4）糖液颜色浅，质量高。,缺点： （1）生产周期长，一般需要48小时。 （2）需要更多的设备，且操作严格。,（三）酸酶结合法（acid-enzyme hydrolysis method）集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分：,酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。 适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用-淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底。,2.酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解。适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。,（四）不同糖化工艺的比较,2. 纤维素的降解纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，占地球总生物量的40%，它也是地球生物圈碳素和能量循环的主要部分。由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，所以到目前为止仍没有得到很好地利用。 近几年随着原油价格的不断攀升，纤维素资源的利用引起了世界各国的极大关注和高度重视。我国出于对能源战略的考虑，近几年也加大了对纤维素利用的研究的投入。 （1）纤维素的结构天然纤维素是由D-吡喃式葡萄糖通过-1,4-糖苷键结合形成的线形长链分子，约由700-150,000个左右的残基所构成，一般在3000个左右。,通过分子间的氢键(O3-HO5 and O6 H-O2) 和分子链间的氢键 (O6-H O3) 形成网状平面 并通过疏水面的堆积构成纤维素的晶体结构。,O3-HO5,O6 H-O2,O6-H O3,天然纤维素除了我们上面提到的结晶结构外，还有非结晶区。如下图。,结晶区,无定形区,微生物降解纤维素的酶系降解和利用水不溶性的纤维素，微生物必须产生相应的酶。在过去二十几年里，根据酶对纤维素作用方式的研究，将纤维素降解的酶类分成三类：(i) 纤维素内切酶 endoglucanases or 1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4) (ii) 纤维素外切酶 exoglucanases, including 1,4-D-glucan glucanohydrolases (also known as cellodextrinases) (EC 3.2.1.74) and 1,4Dglucan cellobiohydrolases (cellobiohydrolases) (EC 3.2.1.91)(iii) 葡萄糖苷酶-glucosidases or -glucoside glucohydrolases (EC3.2.1.21). 纤维素内切酶随机在纤维素的无定形区将糖链切断，产生新的链端。纤维素外切酶作用于纤维素链的两端产生纤维二糖。葡萄糖苷酶降解纤维素湖精和纤维二糖为葡萄糖。,教材上也将纤维素酶分为三种C1酶、 CX酶及ß葡萄糖苷酶,天然纤维素 短链纤维素,葡萄糖,纤维二糖,纤维寡糖,纤维二糖,葡萄糖,C1酶,CX酶,ß葡萄糖苷酶,by Small Angle X-ray Scattering. J.Biol.Chem. Vol. 277 pp. 4088740892, 2002,纤维素酶的结构可以分成三个部分：催化结构域、吸附结构域和连接肽。 纤维素酶对纤维素的作用是一个识别、吸附和催化的过程。,纤维素酶的结构和作用机理,3、果胶,半乳糖醛酸以a-1，4糖苷键形成的直链高分子化合物，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起,75%羧基甲基化成甲酯,从广义上讲，果胶酶可以被分为3种类型：原果胶酶：可以把不溶于水的原果胶分解为可溶于水的高聚合体果胶；果胶甲酯水解酶：脱去果胶中的甲氧基基团，促使果胶的脱甲酯作用；果胶聚半乳糖醛酸（解聚酶）：促使果胶中D-半乳糖醛酸的-1，4糖苷键的裂解。,目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌，也有链霉菌产生果胶酶的报道。在细菌中，欧文氏杆菌(Erwinia sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、节杆菌 (Arthrobacter sp.)和假单胞杆菌(Pseodomonas sp.)都产生果胶酶。嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属主要用于在苎麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等方面，应用前景可观，受到较多的关注和研究。已见报道的产果胶酶的霉菌种类大约包括20个属， 如曲霉属(Aspergillus sp.)、灰霉菌属(Botrytis sp.)、镰孢菌属(Fusarium sp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、核盘菌属(Scletorium sp.)和玉圆斑菌属(Cochliobolus sp.)等。目前，黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中，而曲霉属中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，如用于果汁、果酒及中药营养液的深加工等，使得产品质量和外观得以改善，而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量果胶酶，而且黑曲霉属于安全菌株。另外，黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范围内，这也是其被应用于食品工业行业中的原因之一,研究进展,果胶酶,微生物来源蛋白酶制剂常按最适pH分类碱性：pH10以上（2709枯草菌蛋白酶）酸性：pH2-3以下 黑曲霉中性：多 蛋白酶分类：,内肽酶 （蛋白酶） 外肽酶 羧肽酶、氨肽酶,蛋白酶按活性中心可分为丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶；按最适pH值来分又分酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶,葡萄糖 丙酮酸 CO2和H2O,蛋白、核酸降解自己了解（教材或生物化学）,生物大分子,微生物小分子代谢的中间体丙酮酸,葡萄糖,酵解途径,丙酮酸,乳酸、氨基酸、甘油,糖原,核糖+ NADPH+H+,磷酸戊糖途径,淀粉 纤维素,丙酮酸位于无氧分解和有氧分解的交界点上，是糖代谢中具有关键作用的中间产物 从丙酮酸可直接生成丙氨酸，因为它可以与氨基转移反应相结合，故在氮代谢方面也起着重要的作用 和CoA反应能形成乙酰CoA，与脂肪酸的代谢也有重要的关系 因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用,从代谢的角度看丙酮酸,需要掌握的知识,发酵 (fermentation),呼吸作用,氧化磷酸化, 底物水平磷酸化,新陈代谢,同型乳酸发酵, 异型乳酸发酵,双歧杆菌发酵 葡糖分解为丙酮酸的途径 EMP途径特点、关键酶 HMP途径的重要意义、关键酶 ED途径的特点、关键酶 磷酸己糖酮解途径的特点、关键酶 TCA循环的重要特点,单糖分解为丙酮酸的四（五）种途径,分解葡萄糖生成丙酮酸的过程 糖酵解在胞浆中进行 葡糖糖需磷酸活化 1分子葡萄糖经酵解可净生成2分子ATP 是细胞摄入体内的葡萄糖最初经历的酶促分解过程，也是葡萄糖分解代谢所经历的共同途径 是机体在缺氧情况下迅速获得能量的主要途径，也是成熟红细胞获得能量的唯一途径 糖酵解是肿瘤细胞能量代谢的主要方式,关于糖酵解的认识,EMP途径绝大多数微生物均存在,连接TCA、HMP、ED等途径的桥梁,提供ATP和NAD(P)H HMP戊糖代谢，提供NADPH 和碳骨架 ED 不依赖上面两途径单独纯在，补偿途径 PK and HK 某些细菌中,（一）EMP途径,葡萄糖的酵解作用( 又称：Embden-Meyerhof-Parnas途径，简称：EMP途径),活化,移位,氧化,磷酸化,葡萄糖激活的方式,己糖异构酶,磷酸果糖激酶,果糖二磷酸醛缩酶,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,磷酸甘油酸激酶,甘油酸变位酶,烯醇酶,丙酮酸激酶,EMP途径特点：,葡萄糖分子经转化成1，6二磷酸果糖后，在醛缩酶的催化下，裂解成两个三碳化合物分子，即磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。 3-磷酸甘油醛被进一步氧化生成2分子丙酮酸， 1分子葡萄糖可降解成2分子3-磷酸甘油醛，并消耗2分子ATP。2分子3-磷酸甘油醛被氧化生成2分子丙酮酸，2分子NADH2和4分子ATP。,