分子生物学--核酸的生物合成
第十章 核酸的生物合成,第一节 DNA的生物合成,一、DNA的半保留复制 复制：以亲代DNA分子为模板指导合成相同的子代DNA分子的过程。 Meselson等用氮的同位素进行了试验证明了DNA复制为半保留复制机理,半保留复制：DNA复制时以亲代DNA两条链为模板指导合成与其互补的DNA链，这样在子代DNA中，一条链来于亲代DNA，另一条链是新合成的。DNA 的这种复制方式称为半保留复制,半保留复制试验,1. DNA聚合酶：催化反应的要点：底物：四种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）模板：DNA链聚合方式：按照碱基配对原则，将相应dNTP的5磷酸与上一个核苷酸的3 羟基形成3 5磷酸二酯键，即合成方向为5 3，与模板链反平行 。条件：聚合反应必须有引物存在。,二、参与DNA复制的酶和辅助因子,DNA聚合酶催化机理,（1）大肠杆菌DNA聚合酶：共有三种，为DNA聚合酶 I、II、III,2. 引发酶 功能：可以从无到有地以DNA为模板，催化合成一小段与DNA互补的RNA即引物（10个核苷酸左右）。引物酶本身无活性，只有与另外6种蛋白质结合为引发体才可催化引物的合成。,（2）真核生物DNA聚合酶：共有四种，为DNA聚合酶a、b、g、 d,3. DNA连接酶 功能：将复制过程中形成的DNA片段用3 5磷酸二酯键连接起来。,4. DNA解螺旋酶（解链酶） 利用ATP 供应能量，水解碱基间氢键，从而打开DNA双螺旋的双链,5. 单链结合蛋白（SSB） 可与由解链酶解开的单链结合功能：防止单链再次形成双链，防止核酸酶水解多核苷酸链，保护DNA。可以重复使用，即当所结合的单链进行复制时，它就发生解离，而与新解开的单链结合。,6. DNA拓扑异构酶 通过催化DNA拓扑结构的变化，减少由于解链形成的张力和合成的子代DNA形成双螺旋。,7. 其它因子,1. 起始 DNA分子上有特定的起始位点。在一些因子的作用下，DNA部分解链，形成了一个“复制眼”,三、大肠杆菌DNA的复制过程,复制叉模型,DNA 分子中正在复制的部位，称为复制叉。它是由两股解开的亲代链和在其上新合成的子链、酶、因子组成。,2. 延长,复制机理：半不连续复制,DNA复制机理,3. 终止 DNA复制无特定终止位点，复制链到达前面已复制成的片段则自动终止,四、原核与真核细胞DNA复制的特点1. 原核细胞DNA复制的特点：单个起点，多数为双向复制，少数为单向复制2. 真核细胞DNA复制的特点：真核细胞DNA复制与原核细胞DNA复制系统及过程基本相同，不同之处在于：（1）多个起点（2）均为双向复制,（3）酶系统：DNA聚合酶不同，原核细胞两条链是同一种聚合酶催化，真核细胞中是不同聚合酶催化。去除引物、填补缺口的酶不同，原核细胞中是DNA聚合酶 I，真核细胞相应的酶还未找到。因子不同,1. 概念 以RNA为模板合成DNA的过程 2. 反转录酶 存在于真核生物的RNA肿瘤病毒中。 催化特性：以四种dNTP为底物，需模板和引物。以病毒RNA为模板，合成互补DNA。具有核糖核酸酶功能，水解RNADNA杂合分子中的RNA。以自己合成的DNA链为模板合成互补的DNA，从而形成双螺旋分子。 催化过程：,五、反转录（逆转录）,六、基因扩增（人工体外合成DNA）,聚合酶链式反应（PCR）系统：模板（DNA片段）、酶、引物、底物（4种dNTP）过程：,PCR过程,第二节 RNA的生物合成,一、概念 转录：以DNA为模板合成RNA的过程不对称转录：以DNA一条链为模板转录RNA的方式,转录单位：DNA中指导转录一条RNA链的全部序列。 二、大肠杆菌RNA的转录 1. E.coli RNA聚合酶：以四种NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）为底物，以DNA链为模板，按照碱基配对原则，将相应的NTP的5磷酸与上一个核苷酸的3 羟基形成3 5磷酸二酯键，即合成方向为5 3 。聚合反应不需要引物。,RNA聚合酶催化机理,结构：2,全酶 （转录起始）,MW40000 结合启动子,MW155000 催化,MW160000 结合模板,MW70000 识别启动子、起始,2. 转录过程 （1）起始：起始区在转录单位的启动子部位。启动子转录起始过程中，RNA聚合酶识别、结合并开始转录DNA序列。 由三部分组成，RNA聚合酶识别序列、 RNA聚合酶结合序列和解链并开始转录位点。,识别,转录起始,（2）延伸：在RNA聚合酶催化下，以模板链为模板按5 3方向合成互补的RNA链,转录延长,终止的方式： （1）强终止只依靠终止子就可使RNA转录终止，并释放合成的RNA链和RNA聚合酶。又叫不依赖于因子的终止。,（3）终止：RNA聚合酶到达转录终止区，则停止转录。终止子能够使RNA转录停止DNA序列。,强终止机理,（2）弱终止不仅需要终止子，而且需要因子才能停止转录并释放RNA和RNA聚合酶的终止方式。又叫依赖于因子的终止,弱终止机理,RNA转录过程,起始,终止,延长,真核细胞RNA的转录机理与原核RNA转录机理基本相同。主要不同之处为： 1. 启动子复杂 2. 需要多种因子参与 3. RNA聚合酶不同。真核RNA聚合酶有三种，即RNA聚合酶I、 II、 III，它们的性质与功能如下：,另外，线粒体、叶绿体也有各自的转录系统，转录各自的RNA。,三、真核细胞RNA的转录,四、 RNA转录后的加工 1. rRNA加工 （1）剪接：如原核细胞 rRNA前体的加工,（2）修饰：主要是甲基化,2. tRNA的加工 （1）剪切,(2) 修饰： 3加CCA。剪切加工后，全部的真核tRNA和原核细胞中一大类tRNA无3端的CCA，需要在修饰加工中加上。,其它修饰：如还原、糖苷键移位、甲基化等。 3. 真核mRNA的加工 （1）5加帽子，3加尾巴,（2）剪接：真核细胞的蛋白质基因是断裂基因，即一个基因中有的片段具有指导合成蛋白质的信息，而有的片段无此信息。这样指导合成出的hnRNA 中有的片段在mRNA中存在，而有的片段在加工过程中剪切掉了。 DNA和hnRNA中在mRNA中出现的相应序列称为外显子 DNA和hnRNA中在mRNA中出现的相应序列称为内含子,（3）其它修饰,mRNA剪接机理,（1）转录产物的种类：简单转录产物：只产生一种成熟mRNA的hnRNA。复杂转录产物：可产生几种成熟mRNA的hnRNA。（2）复杂转录产物的加工及其产物加工方式：多个切割并加接polyA位点不同的剪接方式例如：大鼠钙调素基因转录的hnRNA的加工,hnRNA,4. hnRNA的多种方式加工,RNA复制酶：催化性质：以4种NTP为底物，以RNA为模板，按照碱基配对原则进行聚合反应，合成方向为5 3 。聚合反应不需要引物。,五、RNA复制 以RNA为模板合成RNA的过程。,第三节 基因工程简介,一、目的基因的取得 1. 逆转录法,2. 限制性内切酶法,3. 人工合成,基因载体：质粒、病毒等基因重组过程：,三、转化、克隆、筛选,二、基因重组,五、基因工程的利用1. 培育新的动植物品种2. 利用微生物作为“生物化工厂”3. 治疗,四、基因扩增聚合酶链式反应（PCR）,
