科创申请书 lis1在神经元迁移过程中的作用及分子机制研究
西北农林科技大学大学生创新创业训练计划项目创新训练项目申请书项目级别 国家级 项目名称 Lis1 在神经元迁移过程中的作用及分子机制研究 项目负责人 戴玉川 学院、年级、专业 生命科学学院 2010 级 生物工程专业 联系电话 18700809314 电子邮件 hongri1991126.com 填表日期 2010 年 4 月 5 日 西北农林科技大学教务处制表项目编号2一、基本情况项目名称Lis1 在神经元迁移过程中的作用及分子机制研究项目来源陕西省“百人计划”资助项目子项目负 责 人戴玉川性别男年龄21学号2010013468所在学院生命科学学院专业生物工程联系电话18700809314电子邮箱hongri1991126.com指导教师赵善廷性别男年龄48研究方向神经生物学职称教授联系电话18700975432电子邮箱zhaoshantingnwsuaf.edu.cn姓名学号学院专业项目分工王彤2010013635生命科学学院生物技术质粒构建王艺璟2010013618生命科学学院生物技术实验动物购买与饲养付悦2010013488生命科学学院生物工程细胞转染戴玉川2010013468生命科学学院生物工程项目其他工作项目成员获奖者奖励、成果名称颁发单位及时间戴玉川校三好学生西北农林科技大学，2011 年戴玉川优秀学生干部西北农林科技大学，2011 年戴玉川专业一等奖学金西北农林科技大学生命科学学院2010、2011 年王艺璟优秀学生干部西北农林科技大学，2011 年王艺璟专业三等奖学金西北农林科技大学生命科学学院，2011 年项目组人员获奖及成果情况王彤专业三等奖学金西北农林科技大学生命科学学院，2010 年3二、立论依据1.项目的研究意义（限 200 字） 大脑发育机制的研究是当今生物学和医学研究领域的热点之一。Lis1 是参与神经元迁移过程的一个重要调节因子，它在大脑皮质发 育过程中有很高水平的表达，但是对于 Lis1 调控神经元迁移的机制仍不清楚。通过对 Lis1 的研究可以使人们能够深入了解大脑中未成 熟神经元的迁移及大脑发育的分子机制，不仅可以提供神经元发育的理论基础，还有助于了解某些遗传疾病的分子机制，并为临床疾病 监测提供前期判断。2.国内外研究现状分析并附主要参考文献（限 1000 字）神经元迁移障碍会导致脑皮层畸形从而引发脑部发育上的严重后果，包括癫痫、智力缺陷1。大脑发育过程中神经元迁移受多种因素调控，其中 Lis1 是参与神经元迁移过程的一个重要调节因子2，其基因的突变会引起神经元迁移异常和无脑回畸形3。通过研究在胚胎发育不同时期转基因小鼠发现，Lis1 单倍体突变的小鼠表现为大脑皮层和海马体的分层缺陷，而其纯合子突变会造成胚胎致死4。Lis1 在胚胎神经元中高效表达，因此推测在单倍体突变小鼠中神经元迁移障碍5。在对不同发育时期的小鼠进行研究的过程中发现，神经上皮干细胞的分裂增殖以及保证细胞均匀分裂不能缺少 Lis1 的存在，其保证了有丝分裂纺锤体正确地导向，使得神经上皮干细胞对称地分裂6。但是它在神经上皮干细胞发育过程中的具体机制尚不清楚7。Lis1 可以调节轴突内的微管运输，影响有丝分裂的正常进行，还可通过直接与细胞骨架作用而影响神经迁移，且通过影响有丝分裂来减少迁移神经元的数目8。由此预测 Lis1 可通过引导分子马达动力蛋白（Dynein）到细胞膜两边的表面而行使前述功能9。有学者发现活体老鼠大脑组织中神经元干细胞的亚细胞行为细节。在大脑发育过程中，神经前体细胞沿着放射状神经胶质纤维迁移到新皮层。无脑回的致病基因 Lis1 的 RNA 干扰（RNAinterference，RNAi）抑制了活体脑组织切片中神经元体细胞的移动而非神经前体细胞的过程延长10。【参考文献】1Liu Judy S. Molecular Genetics of Neuronal Migration Disorders. CURRENT NEUROLOGY AND NEUROSCIENCE REPORTS. 2011.11(2),171-1782余爽,徐群渊.胚胎皮层神经元的迁移及其相关分子机制.基础医学与临床.2005.8.25(8),684-6913Tiziano Pramparo, Yong Ha Youn, Jessica Yingling, Shinji Hirotsune, Anthony Wynshaw-Boris. Novel Embryonic Neuronal Migration and Proliferation Defects in Dcx Mutant Mice Are Exacerbated by Lis1 Reduction. The Journal of Neuroscience. 2010. 30(8)， 3002-30124Koizumi, H., N. Yamaguchi, M. Hattori, T.O. Ishikawa, J. Aoki, M.M. Taketo, K. Inoue, and H. Arai. Targeted disruption of intracellular type I platelet activating factor-acetylhydrolase catalytic subunits causes severe impairment in spermatogenesis. J. Biol. Chem. 2003. 278,12489-124945Moore Katherine D.,Chen Renee, Cilluffo Marianne 等. Lis1 reduction causes tangential migratory errors in mouse spinal cord. JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY. 2012. 520(6),1198-12116Cardoso, C., Leventer, R.J., Dowling, J.J.等. Clinical and molecular basis of classical lissencephaly: Mutations in the LIS1 gene (PAFAH1B1).HUMAN MUTATION.2002.19(1),4-157Jessica Yingling,Yong Ha Youn,Dawn Darling, Kazuhito Toyo-oka, Tiziano Pramparo, Shinji Hirotsune ,Anthony Wynshaw-Boris.Neuroepithelial Stem Cell Proliferation Requires LIS1 for Precise Spindle Orientation and Symmetric Division .CELL. January,2008.132(3),474-4868刘丽蓉，朱学良. “与细胞运动性相关的 NudelLis1dynein 通路功能及调节”研究进展. CHINESE BULLETIN OF LIFE SCIENCES. 2006.18(4)9Tsai,Jin-Wu, Bremner,K Helen, Vallee,Richard B. Dual subcellular roles for LIS1 and dynein in radial neuronal migration in live brain tissue. Nature Neuroscience. 2007.10(8),970-97910活体脑组织神经元辐射型迁移过程中 LIS1 和动力蛋白的双重亚细胞作用.中华神经医学杂志.2008.1,962R-CH2-CH-CH2ClCH3OH+CH3-N-CH2-CH2-N-CH3CH3R-CH2-CH-CH2-N+-CH 2-CH2-N+-CH 2-CH-CH2-RCH3OHCH3CH3CH3OH2Cl-4三、研究方案1. 研究目标（限 200 字）本课题的目的是拟将载体构建、细胞转染等分子生物学技术，子宫内电击转染、免疫组化、激光共聚焦显微镜等形态学技术相结合，研究和分析 Lis1 野型、Lis1 干扰型以及不同 Lis1 点突变对神经元迁移的作用和影响，对阐明神经元迁移的机理和大脑发育的分子机制提供理论基础和实验数据。2.研究内容（限 400 字）(1)质粒构建利用相关技术克隆 Lis1 野型、干扰型以及突变型，并将其构建至 pCAG-MCS 载体上并设计对照组。(2)Lis1 表达量对细胞形态、细胞骨架及粘附分子的影响将构建好的 Lis1 载体转染至细胞中，在体外观察和研究 Lis1 表达量对细胞形态、骨架和粘附分子的影响。(3)Lis1 超表达和 RNA 干扰 Lis1 蛋白表达对神经元迁移的影响将表达野型的 Lis1 和含有沉默 Lis1 的质粒载体分别与表达 GFP 的质粒共转染到胚胎小鼠大脑新生的神经元中并观察和分析被转染后迁移神经元的形态结构特点。将以上结果与相应空载体质粒转染对照组进行对比，分析 Lis1 表达量对神经元迁移的影响。(4)Lis1 突变体构型对神经元迁移的影响将突变体质粒与表达 GFP 的质粒通过子宫内电击转染技术共转染到胚胎小鼠大脑新生神经元中，运用与上述 3 中的相同策略研究和分析 Lis1 不同位置点突变对神经元迁移的影响。3.拟解决的关键问题（限 200 字）(1)将表达各种 Lis1 的质粒（野型、干扰型、突变型）转染细胞系应用 RT-PCR 和 WB 研究它们是否表达相应的蛋白质，应用免疫组化 观察和研究它们对细胞的形态、细胞骨架及粘附分子分布的影响。(2)Lis1 表达量以及干扰型及突变型对神经元迁移的影响，包括形态变化造成的影响、迁移方向。64. 拟采取的研究方法及技术路线（限 800 字）（1）研究方法：本课题将主要应用 RT-PCR 技术构建 Lis1 野型、干扰型及点突变质粒载体，然后将质粒转染到细胞系中，应用 RT-PCR、Western blotting 和免疫组化技术检测 Lis1 的表达量及细胞形态，细胞骨架分子的变化，然后进行子宫内电击转染、荧光免疫组化、激光共聚焦显微镜，观察和研究 Lis1 的表达量及其点突变对神经元迁移和大脑发育的影响。·（2）技术路线图：75实验方案（限 500 字）(1)质粒的构建：利用分子生物学技术将野型及突变型的 Lis1 序列插入到 pCAG-MCS 质粒中并构建含有引起 Lis1 mRNA 降解的小 RNA 序列的质粒载体，用于抑制神经元中 Lis1 的表达。(2) 细胞培养及转染将 CHO 细胞接种于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液（含 100 IU/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素） ，在 37、5%CO2的条件下培养，每 2-3 天换液 1 次。实验分为 3 组：对照组、空载体组和目的组。(3) RT-PCR和Western blotting：我们将重组质粒转染细胞，提取细胞总 RNA 和总蛋白，检测目的基因以及相关基因的 mRNA 和蛋白表达。(4) 细胞免疫组化染色：将转染后的细胞使用 4%甲醛溶液固定，然后加入一抗、二抗，最后使用 DAPI 进行胞核染色。染色结束后在激光共聚焦显微镜下观察，对结果进行分析和测量。(5) 子宫内电击转染：取孕期为 14.5 天的孕鼠，用电转仪进行电击
