分子生物学常用技术

分子生物学 常用技术核酸的分子杂交Nucleic acid hybridization分子杂交的原理： DNA具有变性的特点 变性的DNA还能复性 分子杂交的概念 分子杂交的原理：用已知的DNA序列制 成探针，来检测末知的样本DNA。当条件改变时当条件复原时单链DNA被 同位素标记 后制成探针核酸分子杂交的基本过程:首先要确定检测的目标，即检测的目的 核酸片段，这个片段的序列必须是已知的 。根据此设计一个探针（与检测目的核酸 互补的序列），并对其进行合成和标记。再通过杂交实验来完成探针对目的核酸 的检测。 分子杂交的形式：液相杂交固相杂交它们之间的区别和优劣固相杂交的一般过程1. 首先设计、合成探针。2. 收集标本，并提取核酸。3. 将提好的核酸样本点到固相支持物上 。4. 封闭。5. 通过变性和复性完成杂交。6. 漂洗7. 放射自显影 核酸分子杂交技术的演变斑点杂交southern blotnorthern blot原位杂交芯片技术斑点杂交southern blotsouthern blot原位杂交 染色体原位杂交 组织切片上的原位杂交抗衰老基因klotho基因的原位杂交芯片技术GeneChip® Array Construction11 µmMillions of copies of a specific oligonucleotide probeImage of Hybridized GeneChip Array500,000 different complementary probes Single stranded, labeled targetOligonucleotide probe*GeneChip® ArrayHybridized Probe Cell1.28cm1.28cmDNARNADNA and RNA MonitoringDNA and RNA MonitoringGenotyping: Is it A or B?Gene Expression: Which genes? How much?Eukaryotic CellDec 2002 Golden PathBlue = STR from CIDR panel Black = GapsMedian intermarker distance: 4.7 MbMean intermarker distance: 5.6 MbMean genetic gap distance: 8.9 cMAverage Heterozygosity 0 .76Median intermarker distance: 105 kbMean intermarker distance: 210 kbMean genetic gap distance: 0.32 cMAverage Heterozygosity 0 .37Dec 2002 Golden PathRed = at least 1 SNP per 100 kb Black = Gaps10k Coverage: Genome 11,555 SNPsMedian intermarker distance: 8.5 kbMean intermarker distance: 23.6 kbAverage Heterozygosity 0 .30Average minor allele frequency 0.22July 2003 NCBI bld 34Red = at least 1 SNP per 100 kb Black = Gaps in genome coverageMapping 100K Coverage: 116,204 SNPs 92% of genome within 100kb of a SNP 83% of genome within 50 kb of a SNP 50% of genome within 15 kb of a SNP 25% of genome within 5 kb of a SNP聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR)PCR技术的形成及发展 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司 人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有 划时代意义的聚合酶链反应。其原理类 似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供一种合适的条件 摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合 酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性 及延伸的温度与时间, 合成DNA的原料。 PCR示意图PCR的改进与完善 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是： Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每 次循环都要重新加。引物链延伸反应在37 下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配 ，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段 不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽 较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由 于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性 时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成 一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了 不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能 引起生物医学界的足够重视 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜 热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐 热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温 ，在70下反应2h后其残留活性大于原来的 90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的 40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次 扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段 特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb) 。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵 敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多 聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现为 PCR技术的广泛应用打下了基础。PCR 技术的实验原理 模拟细胞内DNA合成的过程 利用了DNA变性、复性和能进行杂交的特点 ，在引物存在的条件下DNA聚合酶开始对 DNA进行体外合成。 通过全自动的热循环仪来完成PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3 高温变性1 低温退火2 重复13步 2530轮目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链 与引物复性子链延伸 DNA加倍DNA变性 形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点模板DNA第1轮扩增 第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR反应的基本条件 模板的制备模板是进行DNA体外扩增的依据，它的来源于不同 的材料。PCR对模板的质量要求很高，但对它量的要求 不高。制备模板的材料：新鲜材料：人或动物的血液及组织中提取；从少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法医学的材料：血斑、精斑等；考古材料从以往保存的材料，如石蜡切片的蜡块中。提取的原理和方法：（略）引物的设计：引物的设计首先要依据你已知的序列来设 计。即你要扩增的目的DNA片段。这些资料 可以从文献上查找或从互联网上来检索。实际做的过程中，引物也可借助于别人已 经发表的引物来。但从经验上说，别人公开 发表的引物常常含有一定的错误。所以要进 行核查。 设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条 件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带 。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧 啶 核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物 间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二 聚体，产生非特异的扩增条带。引物-3端的碱基，特别是最末及倒数第 二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被 扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对 酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条 引物的浓度0.11umol或10100pmol， 以最低引物 量产生所需要的结果为好，引 物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且 可增加引物之间形成二聚体的机会。PCR所用试剂：DNA聚合酶buffer:包括两种，一种是含Mg+，一 种是不含Mg+ 。dNTPs纯净水 自己要准备的模板DNA的制备和引物 的设计与合成。PCR的操作过程 设定一个加样配方： 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 5ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 50ul加样：单样本加样多样本加样加样的顺序 PCR反应条件的设定：预就性温度： 94，5分变性温度： 94，30秒退火温度： 需要摸条件延伸温度： 72，30秒总延伸温度： 72，15分1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3 高温变性1 低温退火2 重复13步 2530轮目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链 与引物复性DNA变性 形成2条单链子链延伸 DNA加倍PCR运行图PCR结果的鉴定 通过凝胶电泳的方式来进行。RT-PCR(reverse transcription-PCR) RTPCR的原理 RTPCR技术的应用用于制备基因工程的目的基因片段。用于表达谱的检测。PCR技术的应用PCR的初衷是为特异性的扩增某段DNA 现在PCR在医学研究中主要是用于基因诊断， 常用于：对遗传病的突变基因进行诊断对病原体的基因诊断通过PCR结合限制酶切的诊断SSCP技术进行点突变的诊断 RT-PCR进行结构基因的扩增及定量表达 荧光定量PCR技术 PCR结合多态性分析PCR扩增产物的多态性分析有2种情况：限制片段多态性分析(A)、(B)重复序列多态性分析(A)、(C)PCR-限制片段多态性分析重复序列多态性分析 SSCP技术进行点突变的诊断实时荧光定量PCR技术电泳技术 electrophoresis technology核酸的凝胶电泳 一、基本原理 1核酸分子在水溶液中 呈多聚阴离子。加上电 场，它们会向正电极的 方向迁移。 2在一定的电场强度下 ，DNA分子的迁移速度 取决于核酸分子本身的 大小和构型。3电泳环境的影响：缓冲液的组成和离子强 度直接影响迁移速度。 当电泳缓冲液中无离子时，溶液导电性极小 ，电泳速度慢。 当电泳缓冲液中离子浓度极强时，