双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cdna序列拼接...

分孙生劳学笑憩双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析教师:程琳2011年11月实验目的1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理,掌握DNA测序的基本方法;2、学会序列查询、核酸及蛇白质的同源性搜索和比对。一、DNA测序的方法DNA测序技术主要有两种方法,都是在20世纪70年代中期发明的。A.双脱氧链终止法(thechainterminationmethod),是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。B.化学降解法(chemicaldegradationmethod),是将双链DNA分子用化学试剂处理,产生切口,用同位素标记进行测序。1.Sanger双脱氧链终止法测序原理利用DNA聚合酶和陆双脱氧链终止物测定DNA核芭酸顺序的方法,是由英国剑桥分子生物发明的。dtNTP基本原理:Y聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子;Y利用DNA聚合酶不能够区分QNTP和dQQNTP的特性,使dQNTP参入到寡核苷酸链的3“-札端。因为ddNTP3不是-OH,不能与下一个核苷酸聚合延伸,从而终止DNA链的增长。oTAGCAACT一一一一一一一一5基_二薹立】工TcGnG沥茎光国够弛胸洁弹朱强河。邑J引物延长粕含威蝎颤怀ddATPTPdATP+ddATPdGTPdGTPdGTP+ddGTPdcTPdCTPdcTPiddcTPdCTFdCTPdTTF+ddTTPdTTPdTTPdTTP1一OL-ATCGTddT尔TCSTTadc-ATCGddT-ATddC八F糟'蠹豁鸢1【二GT了G膈-Addr01交,英朋T<2A-ATCGTTGddAA租?a1amsATddCc5-AddT医-ddA2、具体操作:测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,GJT核芭三磷酸(称为QQATP,dQQCTP,dQQGTP,dqQTTP),然后进行聚合反应。在第一个反应中,QdQATP会随机地代萧dATP参加反应,一旦ddATP加入了新合成的DNA链,由于其第3位的-OH变成了-H所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。同理第二个反应产生的都是以C结尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了。假如有一个DNA,互补序列是GATCCCAT,我们试着做一下在第一个反应中由于含有QNTP+dQdATP,所以遇到Gy口C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dQATP或ddATP,比如已合成到Gy下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP探入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT、.产生的都是以A结尾的片殿:GA,GTCCcA将得到如下结果:产生的都是以C结尾的片段:倩ssasix:产生的都是以T结尾的片段:坤“E制得的四组混合0物全部平行地点加在1变性聚丙烯酸受凝胶F形电泳板上进行电泳,冒碳渊帅妻董叠菖钧剐已“根组制品中的名个组2振Y2分将按其链长的不同8万一得到分离,从而制得;相应的放射性自显影2图谱。从所得图谱即:可直接读得DNA的碳麦基序列。即可得到测序结果:为GATCCGAT10