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SNP检测方法(讲课版)

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SNP检测方法(讲课版)

SNPs的检测方法唐敏2005.8.121主要内容nSNPs的定义nSNPs的研究意义nSNPs的研究进展和方向nSNPs的检测方法2SNPs的定义定义:单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因 组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性。 (99.9%)3SNPs的研究意义1. SNPs作为第三代遗传标记(已知性、可 遗传性、可检测性),用于疾病基因的 定位、克隆和鉴定。_路标的作用 传统研究策略(表征、蛋白、基因) 逆向遗传学(表型、基因、蛋白),42.基因多态性研究研究SNPs本身对机体的影响(生理特征、 病理条件下的千差万别)5SNPs研究进展和方向1. SNPs数据库的构建发现 2. SNPs功能的研究(在1的基础上)6SNPs检测方法1.理想的检测SNPs的方法发现未知的SNPs,或检测已知的SNPs (1) 灵敏度和准确度的要求(反应原理严紧 ) (2) 快速、简便、高通量(操作和分析的自动化程度高) (3) 费用相对低廉72.现状:到现在还没有一个符合以上条件的理想方 法出现,但根据实际情况,可以选择出较合 适方法。83.每种SNPs的检测方法都可将之看成由区分SNPs特异位点的原理方法和数据的检测分析手段两部分组成 。9SNPs检测方法的分类一、区分SNPs 位点的 方法 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.以构象为基础的方法 4.直接测序的方法二、检测分析技术 1.凝胶分析技术 2.荧光检测技术 3. DNA 芯片 4.质谱检测技术 101.基于杂交的方法n原理:短的核苷酸探针在和互补的目的片段进 行杂交时,完全匹配和有错配两种情况 下,根据杂交复合体稳定性的不同而将 SNPs 位点检测出来。 (差异越大,检 测的特异性就越好)111)利用Tmn固定温度等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ,ASO) 。修饰过的探针:引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等n 动态的加热过程 动态等位基因特异 杂交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH) 12核酸肽探针 (Peptide nucleic acids,PNA)n其骨架是肽键n特点: 1、与靶分子高特异性地结 合(3个方面的影响) 2、链挤入 (形成三链复合 结构)(表达调控以及 反义治疗方面) 3、对核酸酶和蛋白酶均不 敏感(体外应用)131、与靶分子高特异性地结合nTm值高n受盐浓度影响小(低盐浓度的体系)nTm更大(一个PNA碱基的错配会使其 Tm值降低8-20度) 所以,PNA/DNA的非特异结合能得到很好 的排除。14LNA(locked nucleic acids) n其结构是在RNA分子的2 羟基和核糖环的4碳原 子间连入一个亚甲基的“ 桥”。n特点:1.能以很高的亲和性和互 补的DNA、RNA 或LNA 结合(构象更利于杂交 的稳定)2.匹配和不匹配的Tm增 加15DASH(dynamic allele-specific hybridization)162)杂交+荧光共振分子信标(双分子间杂交) 蝎状探针(分子内杂交)17分子信标(Molecular beacons )18蝎状探针 (Scorpion primer) 192.基于酶的方法1)DNA聚合酶 2)连接酶 3)限制性内切酶 4)外切酶FEN 5)RNase H201)DNA聚合酶n等位基因特异性PCRn多重等位基因特异性PCRnTaqman法n引物延伸法n焦磷酸测序法21等位基因特异性PCR22Taqman 法23微测序法/引物延伸法24基本步骤(液相)1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA 2.对PCR产物进行纯化(去除引物和dNTP) 3.引物延伸 4.延伸产物检测( 放射性同位素标记法、 发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法 、 质谱分析法、变性高压液相色谱法等 )25APEX (arrayed primer extension)固相26焦磷酸测序法 (Pyrosequencing )nDNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、荧光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷双磷酸酶 ( apyrase) 。n原理:DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进 行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随 焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下 能引一种发化学发光反应,通过发光计的实 时监测来达到检测的目的。27基本步骤1.测序引物和DNA模板杂交(PCR扩增的、单链的),与 酶和底物孵育。 2.四种dNTP(dATPS,dTTP,dCTP,dGTP)之一被加 入反应体系,如与模板配对,与引物的末端形成共价 键,dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。 3.一系列的酶学反应,发出可见光信号。每个光信号的峰 高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 4. ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬 灭光信号,并再生反应体系。 5.然后加入下一种dNTP。28292)连接酶n联合链式反应 (combined chain reaction , CCR) n连接-滚环扩增反应 (ligation-rolling circle amplication , LRCA) 30

注意事项

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