20071016-质粒DNA的提取及定量定性分析
Q&A 关于PCR结果分析 关于产物回收 漂洗作用：换缓冲液，除杂 乙醇：保存目的产物 离心：去乙醇，除液体，保证后续工作 补救：勿轻易弃置；高盐结合，重复漂洗。 关于1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12Fig. 1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products. Lane 1Lane 12：products of PCR M：DNA marker （from top to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp ，250bp，100bp）引物或其二聚体问题：10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热 启动不够？ 回收，重新电泳鉴定。1、12泳道：未加引物或模板。相邻泳道溢出污染非特异性！Good！PCRPCR仪中的仪中的 位置位置边缘效应？！胶融！外溢胶融！质粒DNA的提取及其定性定量分析基因的克隆与表达专题之二基因的克隆与表达专题之二主要内容ü一、质粒DNA提取ü二、琼脂糖电泳鉴定及半定量ü三、紫外吸收定量及纯度检测基本原理 结构差别 分子量差别 变性复性SDS碱裂解碱裂解碱变性一、质粒DNA的提取流 程接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜4000rpm、离心1min，收集所有菌体150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清 接菌培养收菌碱裂解加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒 DNA复性 12000rpm，离心10min 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min 上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min 复性回收纯化上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min 12000rpm，离心10min 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） 12000rpm，离心5min 沉淀于超净台中风干（5min20min） 沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解 -200C保存醇沉回收溶解保存离心 标识碱裂解溶液冰浴pH 8.0剧烈振荡10 min溶液粘稠混浊碱裂解溶液现用现配切勿振荡！颠倒混匀T 5minSDS包被！复性回收溶液冰上预冷切勿振荡！颠倒混匀15min仅质粒复性？在哪相？！Ø制 胶：1%琼脂糖（20 mL，1xTAE)Ø缓冲液：1xTAE，130 mLØ制 样：质粒DNA 2L 10xloading 0.5LØMarker：5LØ电 泳：80伏恒压Ø结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量二、质粒DNA的电泳Ø测定流程：质粒DNA稀释100倍（用TE缓冲液稀释），总体积300 LØ检测波长：Ø定量：C=OD260*50*稀释倍数（ g/mL ）Ø纯度指标：三、质粒DNA的紫外吸收检测260nm核酸 280nm蛋白OD260/OD280比值范围：1.82.0污染成分：蛋白,酚 质粒DNA RNA下次实验的简介与准备DNA 重 组酶切和连接基因的克隆与表达专题之三基因的克隆与表达专题之三预实验中如何进行对照？思考：工程菌的常用种类及用途？质粒的种类及特性？分子生物学中常用的内切酶？连接酶？抗生素种类？为什么应用抗生素？灭菌：1mL、200L、 10L枪头各一盒1.5mL小指管 40个2000 1000 750500 200 100M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C关于关于PCRPCR退火条件摸索退火条件摸索
