临床医学检验-临床免疫学与检验
第四篇 临床免疫学与检验吉普塞舞神第一章 概述免疫应答的过程 1、识别阶段：巨噬细胞等抗原递呈细胞对外来抗原或自身变性抗原进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给T辅助细胞（Thc）及相关淋巴细胞的过程。 2、活化阶段：B细胞接受抗原刺激后活化、增殖、分化为浆细胞；T细胞在接受抗原刺激和协同刺激双信号后活化、增 殖、分化为效应细胞。 3、效应阶段：浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能；T细胞中 的Th细胞分泌细胞因子等效应分子，T杀伤细胞执行细胞毒效应功能。吉普塞舞神第一章 概述免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。（一）中枢免疫器官 1、骨髓：造血干细胞（HSC）分化、发育、成熟 2、胸腺：T细胞发育的重要中枢器官 （二）外周免疫器官及组织 1、淋巴结 2、脾：最大的外周淋巴器官 3、粘膜伴随的淋巴组织：如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结、阑尾淋巴细胞再循环与归巢淋巴细胞在体内依靠归巢受体由定居地经淋巴循环及血液循 环不断往返于外周免疫器官、二级淋巴组织及全身器官组织、淋巴循 环汇集于胸导管，经上腔静脉进入血液循环。血液循环中的淋巴细胞及各类免疫细胞在毛细血管后微静脉 处穿越高壁内皮细胞，进入淋巴组织及淋巴器官，再次进入淋巴循 环。吉普塞舞神第一章 概述免疫细胞（一）淋巴细胞 1、T细胞：胸腺依赖淋巴细胞；约占淋巴细胞的70%75%。T细胞受体（TCR）：又称T细胞抗原受体，是T细胞特有 的表面标志。T细胞识别抗原和转导信号是由TCR特异识别MHC分 子递呈的抗原肽，CD3分子转导T细胞活化的第一信号。簇分化抗原（CD）：T细胞发育不同阶段的亚群存在不同的 分化抗原，这是区分T淋巴细胞的重要标志。 2、B细胞：骨髓依赖性淋巴细胞，约占淋巴细胞的5%25%。 主要功能：产生抗体、递呈抗原、分泌细胞因子参与免疫调节。 B细胞受抗原刺激后可分化为产生抗体的浆细胞和长寿记忆细胞。 3、自然杀伤细胞（NK）NK细胞无需抗原刺激，可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的 细胞，因此在免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。活 化NK细胞可分泌IFN和TNF等细胞因子，参与免疫调节作用。吉普塞舞神第一章 概述免疫细胞（二）免疫辅助细胞 1、单核-巨噬细胞系统 共同特点是表达MHC类分子及具有吞噬作用。 2、树突状细胞 专职抗原递呈细胞吉普塞舞神第一章 概述免疫分子（一）免疫球蛋白 分泌型（sIg）：主要存在于体液中，具有抗体的各种功能。 膜型（mIg）：表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白，为抗原受体。 化学结构：2条重链（H）和2条轻链（L）以二硫键连接在一起。V-可变区；C-恒定区按照体内含量的多少分为：IgG、IgA、IgM、IgD、IgEIg的轻链分为链和链，一个天然Ig分子的两条轻链相同。吉普塞舞神第一章 概述免疫分子（一）免疫球蛋白 1、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白，是再次应答的主要抗体，也是唯一能通过胎盘的抗体。大多数抗菌抗体、抗病毒抗体都是IgG，某些自身抗体及超敏型抗体也是IgG，免疫检测中第二抗体也以IgG为主。 2、IgA：大部分血清型Ig为单体；分泌型sIgA为二聚体。每一个sIgA分子含一个J链和一个分泌片。sIgA性能稳定，主要存在于胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，是参与黏膜局部免疫的主要抗体。 3、IgM：五聚体，Ig分子中最大的，主要存在于血液。是个体发育最早合成的抗体，也是抗原刺激后最先产生的抗体。感染过程中IgM水平升高，说明近期感染；新生儿脐血中若IgM增高，说明有宫内感染。 4、IgD：作用不明，B细胞膜上的IgD可作为B细胞分化成熟的标 志。 5、IgE：单体结构，血清中最少。亲细胞抗体，介导型超敏反应 ，在特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。吉普塞舞神第一章 概述免疫分子（二）补体系统补体是存在于人和脊椎动物正常新鲜血清及组织液中的一 组具有酶样活性的球蛋白。 补体的大多数组分都是糖蛋白，多属于球蛋白。 含量最高的补体：C3、C4 含量最低的补体：C2补体性质不稳定，加热56、30min可使血清中绝大部分 补体组分丧失活性，称为灭活。 补体的激活途径： 1、经典途径：以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂，补体C1C9共11种成分全部参与了激活途径。 2、替代途径：又称旁路途径。病原微生物等细胞壁成分提供接触面直接激活补体C3，然后完成C5C9的激活过程。激活物主要是细胞壁成分。 3、MBL途径：由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素（MBL）与病原体结合后启动激活。 补体既可参与机体的防御效应和自身稳定，亦可引起免疫损伤。吉普塞舞神第一章 概述免疫分子（三）细胞因子 免疫细胞分泌的多肽或小分子蛋白质。 通过自分泌、旁分泌、内分泌的方式发挥作用。 按生物学功能分：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家 族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子。 细胞因子受体分：免疫球蛋白基因超家族、I型细胞因子受体家 族、型细胞因子受体家族、型细胞因子受体家 族、趋化性细胞因子受体家族。 （四）黏附分子黏附分子（CAM）是介导细胞间或细胞与细胞外基质间 相互结合和黏附作用的小分子多肽或糖蛋白。以受体-配体的结合 形式发挥作用。参与机体免疫应答、炎症发生、凝血、创伤愈合和 肿瘤转移等病理生理过程。 （五）CD抗原人类白细胞分化抗原（HLA）是指血细胞在分化成熟及 活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。吉普塞舞神第二章 抗原抗体反应一、抗原抗体反应的原理抗原抗体是一种非共价结合、不形成共价键。 1、静电引力；2、范德华力；3、氢键结合力； 4、疏水作用力：是这些结合力中最强的。亲和性：是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相适应而存在的引力，它是抗原抗体间固有的引力。 亲和性用平衡常数K来表示，K值越大，亲和性越强，结合越牢固。抗体是球蛋白，溶解在水中为胶体溶液，不会发生自然沉淀。吉普塞舞神第二章 抗原抗体反应二、抗原抗体反应的特点1、特异性； 2、可逆性：亲和层析法就是利用这个原理来纯化抗原或抗体。 3、比例性：只有当抗原抗体分子比例合适时充分结合，沉淀物形成快而多，称为抗原抗体反应的等价带；若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成 ，称为带现象，抗体过量时，称为前带，抗原过量时，称为后带。 4、阶段性：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合的阶段，反应快 ；第二阶段为可见反应阶段，反应慢。吉普塞舞神第二章 抗原抗体反应三、影响抗原抗体反应的因素抗体的浓度、特异性和亲和性都影响抗原抗体的反应。等价带 的宽窄也影响抗原抗体复合物的形成，单克隆抗体不适于沉淀反 应。颗粒性抗原出现凝集反应； 可溶性抗原出现沉淀反应； 单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀反应。环境因素 1、电解质：抗原抗体发生特异性结合后，由亲水胶体变为疏水胶体 ，此过程需要电解质参加，常用0.85%NaCl。 2、酸碱度：一般在pH 69之间。 3、温度：一般以1540为宜。吉普塞舞神第三章 免疫原和抗血清的制备免疫原：指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。一、颗粒型抗原的制备 各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒型抗原 1、细胞抗原（如绵阳红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液 洗净，配置一定浓度即可。 2、细菌抗原多用液体或固体培养基，经集菌后处理。 颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。二、可溶性抗原的制备与纯化 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片 段、核酸等。 胃蛋白酶或胰酶处理，可获得游离的单个细胞。 溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等使细菌或组织裂解。 木瓜酶将IgG裂解成2个Fab片段和1个Fc片段； 胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab，）2片段及数个小片段； 胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。吉普塞舞神第三章 免疫原和抗血清的制备三、半抗原性免疫原的制备半抗原：某物质在独立存在时只具有抗原性而无免疫原性。 半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。载体 1、蛋白质类：以牛血白蛋白最常用。 2、多肽聚合物：常用多聚赖氨酸。 3、大分子聚合物和某些颗粒。半抗原性免疫原的鉴定 一般认为至少要20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才 能有效刺激免疫动物产生抗体。因此，在半抗原与载体连接后，应 测定半抗原与载体的比例。 1、吸收光谱分析法 2、放射性核素标记半抗原渗入法吉普塞舞神第三章 免疫原和抗血清的制备免疫佐剂佐剂的种类 1、化合物，如弗氏不完全佐剂 2、生物制剂，经处理改造的细菌及代谢产物，如卡介苗；细胞因子及热休克蛋白等。弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂 弗氏完全佐剂=弗氏不完全佐剂+卡介苗 使用时加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原与佐剂形成油包水乳 剂。 佐剂和抗原的比例为1:1。佐剂的作用 1、改变抗原的物理性状、延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺 激免疫系统； 2、刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和递呈抗原的能力； 3、刺激淋巴细胞增殖和分化； 4、致变抗体的产生类型和诱导迟发型超敏反应。 吉普塞舞神第三章 免疫原和抗血清的制备抗血清的制备含有抗体的血清即抗血清。 抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。 R型抗血清：用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较宽，适于作为诊断试剂。 H型抗血清：用马等大型动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般作为免疫治疗。某些动物体内有类似物质时，蛋白质抗原对这些动物免疫原性极 差。 如：IgE对绵羊；胰岛素对家兔；多种酶类对山羊。吉普塞舞神免疫程序 1、免疫原的剂量：剂量过大或过小都有可能产生免疫耐受，在一定剂量范围内，免 疫原剂量越大，产生的抗体效价越高。 2、免疫途径：皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、淋巴结等途径。皮内或皮下免 疫时一般采用多点注射。初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗 粒性抗原一般选择静脉注射。宝贵抗原可选择淋巴结内微量注射。 3、免疫间隔时间第1次与第2次免疫间隔时间以1020天为好，第3次及以后 的间隔一般为710天。采血法 1、颈动脉采血法 2、心脏采血法 3、静脉采血法第三章 免疫原和抗血清的制备吉普塞舞神第三章 免疫原和抗血清的制备抗血清的鉴定 1、抗体特异性的鉴定 常用双向免疫扩散法，观察沉淀线。 2、抗体效价的测定 颗粒型抗原-凝集试验 可溶性抗原-双向免疫扩散试验、ELISA等 稀释方法： 将经过系列稀释的血清分别与一个浓度的抗原反应； 同时稀释抗原和抗血清，分别与不同浓度的抗血清进行双向免疫扩散实验（棋盘滴定） 3、抗体纯度的鉴定 SDS-PAGE、双向免疫扩散试验、免疫电泳等抗血清的保存 短期保存：28； 冷冻：-80-20，分为小包装，一般保存5年，避免反复冻融。 真空干燥：510年吉普塞舞神第三章 免疫原和抗血清的制备抗血清的纯化IgG类抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和 层析法。杂质的去除：1、亲和层析法2、吸附剂法吉普塞舞神第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备杂交瘤技术：利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细 胞与具有体外生长繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体。这种杂交瘤 细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗 体。小鼠骨髓瘤细胞：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株 肿瘤细胞合成DNA一般有两条途径：一条是生物合成的主要途径，利 用糖和氨基酸合成核苷酸进而合成DNA，叶酸拮抗物（甲氨蝶呤）可 阻断该途径；另一条是替代途径，当叶酸代谢受阻时，细胞通过 HGPRT和TK利用核苷酸的前体合成核苷酸，进而合成DNA。因此筛选杂 交瘤细胞用HAT培养液。 HAT培养液：在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶 核苷。细胞的选择： 有限稀释法、显微操作法、
