X射线晶体衍射技术

蛋白质晶体X-射线衍射仪Protein X-ray diffractometer 型号：R-AXISIV+X射线晶体衍射技术在蛋白质晶体结构测定中的应用现代分子生物学引言X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重 要方法。生物大分子X射线晶体学是揭示分子 结构与功能的科学。目前还没有一种工具能够 用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排 列。虽然电子显微镜接近于看到大分子的轮廓 。但是仍然仅限于揭露分子的大小、形状、对 称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法（X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶体 的空间结构。对晶体结构的研究将帮助人们从 原子的水平上了解物质。 发展历史 1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; 1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了 测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的 距离和排列。因此获诺贝尔奖。 1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，-构型的多肽 链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三维 结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解 决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. 1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数 学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型 药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用X-射线结构分析法（X-光衍射法）X-射线是波长很短的电磁波，约0.1-100Å。 结构分析用的是单色X-射线，其波长在1Å数量级，相当于分子中 原子之间的距离。 用于结构分析用的仪器是X-射线仪。由X-射线管、滤波器、高压 系统（30-50KV)、真空系统(10-4-10-5 mmHg柱）和照相机组成。 工作原理：由X-射线管产生的各种波长的X-射线，经过滤波器（ 如镍片等）得到一定波长的单色X-射线。单色X-射线通过晶体， 产生衍射线，用照相机记录下来，得到衍射图，然后，通过对衍 射斑点的位置与强度的测定与计算，并参照化学分析的结果，就 可确定晶体结构。即：光学-实像，通过FT转变。基本原理用X-射线衍射法测定晶体结构是根据晶体中原子重复出现的周期 性结构。当X-射线穿过晶体的原子平面层时，只要原子层的距离d 与入射角的X-射线波长、入射角之间的关系能满足布拉格 (Bragg)方程式： 2d sin=n( n =±1,±2,±3,)则反射波可以互相叠加而产生衍射，形成复杂的衍射图谱。不同 物质的晶体形成各自独特的X-射线衍射图。根据记录下来的衍射 图谱，经过复杂的数学处理，可推知晶体中原子的分布和分子的 空间结构。d d平行光束原子层晶体的衍射X射线晶体结构分析是利用晶体的X射线衍射现象来测定晶体及分 子的结构。而X射线衍射可简单理解为当一束平行的X射线投射到 晶体上时，大部分入射线穿过晶体沿原方向前进，而部分射线却 偏离了入射方向。X射线源入射线 晶体衍射线Protein Structure By X-RayCrystallographyObtain Crystals ;Expose Crystals to X-rays ;Measure intensity of Diffraction; Compute Electron density at every position in the crystal (x,y,z) ;Place poly-peptide chain into electron density. X射线晶体结构测定原理x射线是一种电磁波，能直线传播，使胶片感光。在晶体结构分析中应用 的X射线是波长在o1nm左右的电磁波由于这一波长与晶体内原子间的 距离具有同一数量级以及晶体结构内分子排列的规则性，当X射线入射到 晶体上时晶体中的每一个原子都发射出次生的x射线，并相互干涉，形 成一个衍射花样。如果将这个过程与光学显微镜成像相比较两者有相 似之处。在显微镜下，一束平行的可见光入射到一个物体上，物体散射 入射光，物镜会聚散射光而成像。 对于x射线来说，由于还没有一种材料可作为聚焦镜因此不可能直接会 聚散射光而形成物像，看到晶体内部的结构。但是晶体的衍射花样与晶 体内部的结构有一定的关系，即衍射花样内衍射点的排列方式、点间距 离的大小与晶体内生物大分子的排列方式和重复周期大小有关，而衍射 点的强度分布与生物大分子结构本身的特点有关。 因此，我们可以通过分析衍射点的排列方式和测量点间距离的大小来推 算分子在晶体结构中的排列方式和重复周期的大小，以及通过测量衍射 点的强度，应用一系列数学方法，借助电子计算机可测定分子内每个原 于在空间的坐标，从而测定整个分子的结构和晶体结构。晶体结构的基本知识日常所见的许多晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子 晶体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成晶 体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组为数无限的、相互平行的、情况相同的 平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。 知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。 X-射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射图上 斑点的位置与黑度。衍射线方向：确定晶胞的大小和形状；衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。测定步骤培养大的、质量好的晶体； 进行初步的x射线衍射分析； 重原子衍生物的制备； 衍射数据的测量和处理； 相位的计算； 电子密度图的计算和解释； 分子模型的修正。获得好的晶体是 结构分析中最关键的一步由于球状蛋白分子量较大，而且表面基团的构象较不稳定，欲获 得排列有序的晶体是比较难的。所形成的晶体不可能是完美的堆 砌，在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常常由占晶体 体积一半以上的溶剂分子所占有，这些溶剂分子的绝大部分在晶 体中又是无序的。晶体的蛋白质分子之间仅有少量的区域发生接 触，这些区域的相互作用也是较弱的相互作用，通常是通过一个 或几个溶剂分子层发生作用。这也是为什么由X射线晶体学测定 的蛋白质结构与在溶液中测定的蛋白质结构几乎相同的主要原因 。 欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性是能否获得完好结晶的 关键之一。重组DNA技术在这方面是一个很重要的突破。由高效 表达克隆基因获得的蛋白质能够快速获得纯化，并且只需很少的 纯化步骤就能得到均一的样品。一般来说，一个蛋白质样品要想 使其能结晶，至少需要97%的均一性。生物大分子的晶体培养要求要进行x射线晶体结构分析，首先要得到适合于结构分 析的晶体。这里所谓“适合于”包括两层意思： 晶体内部结构要具有有序性是单晶，不是孪晶，否 则无法得到具有结构本身特点的衍射花样； 晶体要有一定的大小和形状。因为晶体衍射线的强度 大体上正比于晶体的体积，而反比于分子量的大小。 一般讲分子量为50000左右的蛋白质分子，需要0.3 mm3或者更大的晶体，才有可能作高分辨率的结构分 析。对于分子量更大的蛋白质分子，那就需要更大的 晶体。为了满足上述要求，首先要使生物大分子结晶 ，然后设法长大。蛋白质结晶过程是一个有序化过程蛋白质晶体培养一般规律蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序 化过程，即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规 则排列状态的固体。一般认为要使这种有序化过程开 始必须要形成一定大小的晶核，并使分子不断地结合 到形成的晶核上。而一个蛋白质溶液能开始形成晶核 ，就必须使溶液达到过饱和，并保持一定的条件，使 溶液中的分子失去自由运动的能量(平移、旋转等)而结 合到晶核上，形成新的稳定的化学键(次级键)，使整个 体系能量降低而形成晶体。过饱和溶液蛋白质结晶要点蛋白质的分子量很高，几何形状较复杂，表面带多种 电荷； 分子间相互作用或相互结合的点很多，而可能形成有 序排列的关键结合点和几何匹配位置又很少； 在外界条件(如PH、温度、不同溶剂等)的影响下，分 子构象容易产生某些变化； 在蛋白质结晶时必须保持在水合状态，或者在生理 pH和温度条件下。 要使生物大分子结晶和生长出大的晶体最关键的是 控制过饱和度的量和速度过饱和度要低，而速度要 尽可能地慢。蛋白质结晶技术- 悬滴法该法适用于微量的筛选结晶条件。 每个蛋白质溶液的样品只需5u1或者10ul，平衡液只需lml。每次 实验可根据需要设计，如可先配制一系列不同浓度的沉淀剂溶液 ，作为平衡液，然后转移到各个封闭小室内，与含有低于平衡液 50的沉淀剂的蛋白质悬滴液扩散平衡。 最后根据实验结果筛选出一种沉淀剂浓度作为最佳结晶条件。具 体实验可采用16孔的塑料组织培养盒进行、每个孔内加入一定量 的平衡液：每一个蛋白质母液悬滴加在预先硅化好的盖玻片上， 然后把盖玻片倒盖在小池上。为防止蒸发扩散时漏汽，必须在盖 玻片与池边缘间加少量凡士林密封。盖片 悬滴平衡液Hanging Droplet Method for Protein Crystallization 蛋白质结晶技术-坐滴法坐滴法原理与悬滴法相同，不同之处仅为液滴体积增大，如50ul 或更大。 这种方法较易生长出大的晶体，重复性较好，但是蛋白质用量较 大，适合于巳大体知道结晶条件，或者有足够量的样品可供使用 。 其缺点是晶体有时贴在容器底部而不易取出导致损坏晶体。盖片蛋白质溶液平衡液蛋白质结晶技术-平衡透析 微量扩散小室法利用半透膜允许小分子透过而不允许大分子透过的性质，来调节 蛋白质溶液的离子强度或pH值，使蛋白质溶液慢慢地接近过饱和 度。 这种方法的优点是：通过有控制的扩散，改变结晶的条件，从而 慢慢地到达晶核形成点。晶体的生长亦可不断地调整、已经产生 的沉淀或者微晶可通过外部条件的改变重新溶解。 这种方法可以在低离子强度条件下应用传统的盐析方法结晶，它 既适用于大批量的结晶，亦可应用于微量的结晶。 较普遍使用的微量扩散小室是用有机玻璃加工而成的、小室直径 23mm，高45mm。 蛋白质母液加在小室内，上端封一半透膜，然后把小室放到相应 的平衡透析液内。蛋白质母液内的条件通过半透膜与外部溶液平 衡透析而改变。平衡液小室蛋白质溶液橡皮环透析膜在蛋白质晶体中可能出现的11种对称类型表示在纸面上方 表示在纸面下方生物大分子的晶体特征 氨基酸、核苷酸、单糖的分子能以有序的晶体型式存在，并以氢键为 特征，晶胞的大小一般为o5-2nm。这些简单的分子中的原子数目可达 l02，它们是几乎所有生物结构的建造单元。目前。已经测定了所有这些 分子以及大量的衍生物的晶体结构。 肽、类固醇、激素、维生素以及脂类等的一个分子中所含的原子数可 达102-103从生物学的观点看仍是很小的分子。但对于x射线晶体学来 说，已经是非常复杂的了。这些分子在体内的生物学过程的控制方面通 常起着重要的作用。它们能以晶体或液晶等有序性型式存在，已经得到 了一些关于这些分子和它们的晶体结构的资料。其晶胞大小为l-3nm。 纤维状蛋白质、球状蛋白质、核酸和多糖等生物大分子的一个分子中 或一个亚基中含有的原子数目可达102一105。这些生物大分子是现代晶 体学研究最活跃的领域。它们能以纤维结构、层状结构或晶体型式存在 ，晶胞的大小或链的周期一般可从几个-20nm。 生物膜、核蛋白、染色体、核糖体及病毒等是更为复杂的生物学对象 。它们是由大量生物分子如蛋白质、核酸、脂类或糖类等结合或组装而 成的。在一个分子或一个亚基中的原子的数目可达102一108。它们能以 纤维状结构、层状结构或晶体等有序性的型式存在晶胞的大小或链的 周期可从几个-几十甚至几百nm。生物大分子晶体衍射数据的收集和处理收集数据的方法和仪器设备也是