【生物】动物细胞工程第2课时 2023-2024学年高二生物同步备课课件（人教版2019选择性必修3）

聚焦学习目标：1.动物细胞融合技术2.单克隆抗体及其应用第2节动物细胞工程第2课时动物细胞融合技术与单克隆抗体病原体（如流感病毒）B细胞抗原呈递细胞辅助性T细胞B细胞记忆B细胞浆细胞抗体1一些病原体可以和B细胞接触，这为激活B细胞提供了第一个信号。1抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞。3一些病原体被树突状细胞、B细胞等抗原呈递细胞摄取。223456辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合，这是激活B细胞的第二个信号；辅助性T细胞开始分裂、分化，并分泌细胞因子。4一.动物细胞融合技术实例：1970年，科学家用发绿色荧光的染料标记小鼠细胞表面的蛋白质分子，用发红色荧光的染料标记人细胞表面的蛋白质分子，将小鼠细胞和人细胞融合。这两种细胞刚融合时，融合细胞的一半发绿色荧光，另一半发红色荧光。在37下经过40min，两种颜色的荧光均匀分布。小鼠细胞人细胞细胞融合37,40min正常融合的细胞融合细胞红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验示意图1.概念指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。细胞膜具有一定的流动性。物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG）融合法生物法：灭活病毒诱导法2.原理3.诱导方式思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。灭活病毒诱导法灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。动物细胞融合特有的诱导方法仙台病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（能诱导细胞融合）原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。4.过程细胞膜融合细胞核融合细胞质融合形成杂交细胞灭活病毒诱导细胞融合过程5.意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。6.应用：1)细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。2)利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。至今，种间、属间、科间，甚至动植物之间融合都已获得了成功。资料2016年，ACSSyntheticBiology杂志上报道了一个日本科学家团队，他们将拟南芥细胞与人类HT1080细胞融合，杂交细胞中产生出了人类/植物融合染色体，同时还能稳定存活、增殖，进行基因表达的案例。植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能7.植物体细胞杂交和动物细胞融合比较体液免疫抗体抗体的分布：血清（主要）每个（已经免疫的）B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的免疫球蛋白二.单克隆抗体及其应用不能无限增殖产生大量抗体动物体内抗原刺激多种浆细胞多种抗体筛选单一B细胞增殖分化抗原不纯抗体不纯产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。缺陷：如何解决这个问题呢？抗原免疫传统抗血清所有抗体混合1.传统抗体制备方法及缺陷一个极富创造力的方案动物细胞融合杂交瘤细胞动物细胞培养单克隆抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体1975年，米尔斯坦和柯勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖米尔斯坦【英国】科勒【德国】注射特定抗原从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养多种已免疫B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合小鼠的脾脏中获取多种杂交细胞2.制备过程1)获得融合细胞资料分析：HAT培养基资料1：DNA的合成有D途径和S途径两种途径，其中D途径是在叶酸的辅助下，由氨基酸等小分子合成核苷酸；S途径是利用酶，催化次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T）生成相应的核苷酸。资料2：已知氨基蝶呤（A）是叶酸的拮抗物；免疫的B淋巴细胞有这两种途径，骨髓瘤细胞缺乏S途径中的酶。培养基中加入氨基喋呤活动：请根据以上信息，设计从培养液中筛选出杂交瘤细胞的方案。细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。B淋巴细胞骨髓瘤细胞（A）合成DNAD途径S途径D途径氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB302杂交瘤细胞（多种）置于选择性培养基上培养第一次筛选融合的细胞B细胞自身融合未融合的B淋巴细胞B瘤骨髓瘤细胞自身融合未融合的骨髓瘤细胞B瘤B瘤第一次筛选：用特定的选择培养基，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。2)筛选杂交瘤细胞克隆化培养和抗体检测有限稀释法每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞侧面模拟图克隆化培养一段时间取上清液进行抗体检测抗原和抗体能够特异性结合抗体检测的原理是什么？(分子水平的鉴定）3)筛选分泌专一抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞（多种）第二次筛选获得产生专一抗体的杂交瘤细胞使用96孔板培养和筛选杂交瘤细胞，每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养和抗体检测，即可获得大量能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养单克隆抗体体内或体外培养注射到小鼠腹腔4)特异杂交瘤细胞的培养培养杂交瘤细胞的方法比较项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高应用到的技术？原理？细胞膜的流动性多种杂交细胞及未融合的细胞诱导融合小鼠骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞给小鼠注射特定抗原提取杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基第二次筛选足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔大量单克隆抗体克隆化培养、抗体检测（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）（能产生抗体）（能无限增殖）从腹腔液中提取从培养液中提取（进行多次）动物细胞融合动物细胞培养细胞增殖单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较项目第一次筛选第二次筛选筛选原因筛选目的筛选出？筛选出的杂交瘤细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会，只有融合的杂交瘤细胞才能。用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞能分泌所需抗体死亡抗体检测生长诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞优点：准确、高效、简易、快速。3.单克隆抗体的应用1)作为诊断试剂最广泛应用利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。艾滋病检测试剂结合同位素的单抗血型检测试剂结合荧光标记的单克隆抗体药物乙肝测定试剂ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。2)运载药物（生物导弹）优点：位置准确、特异性强、灵敏度高。3)治疗疾病：主要用于癌症治疗,如PD-1抗体或PD-L1抗体。优点：位置准确、疗效高、毒副作用小。随堂练习1.概念检测(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒()(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构()(3)二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞()(4)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞()(5)单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同()(6)ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用()2.如图为单克隆抗体的制备流程示意图。下列叙述正确的是()A.甲是从已免疫的小鼠脾脏中获得的致敏T淋巴细胞B.表示将骨髓瘤细胞去核后进行细胞融合C.乙为融合细胞,同时具有细胞甲和骨髓瘤细胞的特性D.表示筛选能产生特异性抗体的细胞判断正误随堂练习3.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株4.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原制备出了单克隆抗体。正确是A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体CA