流感病毒临床标本的采集方法、运输、保存处理

人感染H7N9禽流感病毒标本 采集、保存、检测及结果反馈省CDC微生物检验科 史永林2013-04-09uu人感染人感染H7N9H7N9禽流感疫情防控方案禽流感疫情防控方案（第一版）（第一版）附件附件2 2：人感染人感染H7N9H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略禽流感病毒标本采集及实验室检测策略 uu人感染人感染H7N9H7N9禽流感诊疗方案禽流感诊疗方案（20132013年第年第1 1版）版） uu人感染人感染H7N9H7N9禽流感医院感染预防与控制技术指禽流感医院感染预防与控制技术指 南南（20132013年版）年版） uu人感染人感染H7N9H7N9禽流感病例诊断程序禽流感病例诊断程序 uu关于做好人感染关于做好人感染H7N9H7N9禽流感病毒实验活动生物禽流感病毒实验活动生物 安全管理工作的通知安全管理工作的通知国家卫生和计划生育委员会临床样本的选择n采样对象： 1.监测病例：同时具备以下4项条件的病例： （1）发热(腋下体温38)； （2）具有肺炎的影像学特征； （3）发病早期白细胞总数降低或正常,或淋巴细胞分类 计数减少； （4）不能从临床或实验室角度诊断为常见病原所致肺 炎。 2.疑似及确诊病例：参照人感染H7N9禽流感诊疗方 案（2013年第1版）（卫发明电20135号）n最佳采集时间：病人发病急性期,即发病的头7天采样液的要求n标本采集后应立即放入适当的采样液中 低温保存n应包含有一定量的营养物质及蛋白质（ 维持病毒活性）和抗菌素（抑制杂菌生 长）。 最佳采样液：Hanks液，Eagels液n推荐：专用病毒样本采集管专用病毒样本采集管临床标本的采集常采集的标本类型®上呼吸道标本（包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽 抽取物、咽漱液和鼻洗液） ®下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺 组织标本） ®血清标本（急性期/恢复期） ®肺组织、气管、支气管组织标本 （死亡病例 ）标本采集量及分装®呼吸道标本每份分为3 管/每管不少于1ml®血清标本每份分为2 管/每管不少于0.5ml u 2 ml螺口带盖塑料管 (不可用1.5ml离心管代替)临床样本收集的注意事项n操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我 保护n采集标本要有一定力度n标本采集后应迅速至于冰上或者4 以下保存，因 为流感病毒对热很敏感n标本管上写明：医院名称，标本号，患者姓名， 性别， 采样日期n标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒 分离。24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 或以下临床标本运送、包装u根据可感染人类的高致病性病原微生物菌（ 毒）种或样本运输管理规定和人间传染的 病原微生物名录的有关规定，人禽流感标本 应当由不少于两人的专人专车护送，并采取相 应的防护措施，不得通过公共电（汽）车和城 市铁路运输（运送前要取得卫生行政部门的审 批文件）u按照生物安全的相关规定进行包装（A/UN2814 ；B/UN3373）u在24 小时内送到当地流感监测网络实验室进行 检测临临床标标本储储存要求p保存在4（不能超过过4天）p或者-70或-70以下，有条件的实验实验 室均应应 保存在-70或-70以下。p不应应保存在-20。p标标本分装保存，尽量避免反复冻冻融。临床标本的处理原则n标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进 行接种分离，24-48h内能进行接种的可置 于4保存，如未能接种应置-70或以下 保存。n血清标本可在4存放一周，长期保存置-20或以下。标本的实验室检测u人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一版）附件2：人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略u人感染H7N9禽流感病例诊断程序u关于做好人感染H7N9禽流感病毒实验活动生 物安全管理工作的通知实验室检测程序（人感染H7N9禽流感病 例诊断程序）n人感染H7N9禽流感疑似病例，先有各省的国 家流感监测网络实验室进行标本的初步检测 。n不具备检测条件的地区，在确保生物安全的 条件下，可将标本送邻近具备相应条件和资 格认证的国家流感监测网络实验室进行初步 检测。n各省行政部门应该鼓励具备条件的实验室按 照技术规范开展标本核酸检测工作，并可以 作为诊断的实验室依据。实验室检测流程1n当地流感监测网络实验室收到标本后24 小时 内，立即对呼吸道标本开展甲、乙型流感病 毒通用引物H5、H7亚型的检测。n若当地流感监测网络实验室检测结果为H5、 H7核酸检测阳性时，应当于24小时内将其中 2管呼吸道相关原始标本分别送省级疾控中心 流感网络实验室和国家流感中心。实验室检测流程2n若当地流感监测网络实验室检测结果为甲型 流感和乙型流感通用引物均阴性时，应当立 即将1管原始呼吸道标本送省级疾控中心。省 级疾控中心收到标本后，应当立即对其中1管 进行SARS 、新型冠状病毒等相关病原体的检 测，另1管送国家流感中心。n当地流感监测网络实验室将采集的血清标本 分别送省级疾控中心和国家流感中心开展病 原体的抗体检测。 实验室检测流程3n当地流感监测网络实验室将采集的血清 标本分别送省级疾控中心和国家流感中 心开展病原体的抗体检测。 n具备相应生物安全条件的网络实验室可 开展病毒分离，并将分离的毒株按要求 及时送国家流感中心。国家流感中心推荐的检测策略特别说明依据人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第一版）u发生人感染H7N9禽流感疫情的省份， 常规流感样病例监测哨点医院采集流感 样病例标本数每周不低于15份，并将 H7核酸检测纳入常规检测项目。实验室检测试剂及方法Ø2010年及之前下发的H7引物不再用于 检测Ø当前的新型H7N9病毒检测以中国 CDC国家流感中心下发的引物和探针 为准（Real-time PCR）Ø目前还没有其它快速诊断试剂和普通 RT-PCR检测试剂检测试剂nQuantiTect Probe RT-PCR Kit（Cat. 204443，Qiagen）nSuperScript Platinum One-step RT-PCR Quantitative System with ROX （Cat. 11745-100，Invitrogen）nAgPath-ID One-step RT-PCR Reagents （Cat. AM1005，ABI）检测方法nReal-time PCR (需要有配套仪器)n反应体系 25uln引物工作浓度 40uMmn探针工作浓度 20uMmn模板量 5uln反应条件 参照各试剂盒说明书AH7Real-time 检测新型H7N9病毒核酸阳性结果标本检测结果反馈和报告n开展实验室检测的疾控中心要及时将标 本信息和检测结果信息报送国家流感中 心，并在24 小时内由网络实验室所在 疾控中心逐级反馈到病例所在医院。n当标本为SARS、禽流感（H5、H7）、 新型冠状病毒或其他新型病原体检测阳 性时，检测结果应当及时报告给同级卫 生行政部门。