免疫酶组织化学技术
免疫酶组织化学技术CK阳性肿瘤细胞组织来源（中间丝标志物 ） EMA阳性肿 瘤 的 病 因 和 发 病 机 理 研 究 HBsAg阳性（病毒及癌基因标志物） 肿瘤细胞功能分类B 细 胞 阳 性（淋巴瘤及神经内分泌肿瘤标志 ） 肿瘤癌前病变和早期诊断P53阳性（癌胚抗原或肿瘤相关抗原）肿瘤病理诊断与鉴别诊断HMB45阳性（各种肿瘤特异性抗原） 肿瘤治疗和预后判断PR阳性（性激素受体，癌基因和细胞增殖活性标志） Cer-bB-2Ki-67阳性第一节 基 本 原 理 抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。免疫酶组化 免疫学(抗原抗体反应) 酶细胞化学(底物显色反应)+特异性 敏感性 定位性 可视性PAP法免疫酶组织化学基本组成：抗原 抗体 放大系统 显色系统ABC法免疫酶特点：信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便，易推广第二节 酶 和 底 物一、酶及其特点酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出 ， 能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散 ， 具有良好定位。 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。酶在PH中性液内较稳定。组织中不应存在与底物作用的内源性酶。符合上述条件：辣根过氧化物酶硷性磷酸酶葡萄糖氧化酶（一）辣根过氧化物酶（HRP） 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内（二）硷性磷酸酶（AKP）从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用 （三）葡萄糖氧化酶（GOD）底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱 二、底物及其特点酶底物酶·底物酶产物（显色）HRP的底物：HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。 HRP显色反应：HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型） 电子供体电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。HRP常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB)黄色AKP底物：AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐偶联试剂：固兰BB蓝色固红TR红色 第三节 酶标记抗体法酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体 HRP复合物组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感性差，一种标记抗体只能检测一种抗原。二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上，抗原-特异性抗体-第二抗体 HRP复合物步骤：二步法组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原。但较直接法费时，非特异染色稍重。 第四节酶 抗 酶 法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体 ） HRP一、PAP法原理：抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP复合物步骤：三步法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法HRP特点：敏感性较高，背景染色较轻但特异性抗体与PAP必须为同一种属动物 二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物 抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP步骤：五步法 特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特异背景重三、APAAP法原理：抗原-特异抗体-第二抗体- APAAP复合物步骤：三步法APAAP法特点：非特异背景较轻，不受内源性酶的干扰。但产物易溶于有机溶剂第五节卵白素-生物素法 Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力一 、ABC法Avidin Biotin Complex原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin酶素化BiotinAvidin - ABC复合物抗原-特异抗体- Biotin标记 第二抗- Avidin Biotin HRP 组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素卵白素 ABC法步骤：三步法特点：敏感性较高，特异性强，应用范围广 某些脏器存在内源性生物素干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应SABC法Streptavidin biotin Peroxidase ComplexSABC法已代替ABC法二、LSAB法Labelled Streptavidin Biotin Method原理： Biotin标记第二抗体LSAB法 HRP标记Avidin抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物 步骤：三步法特点：敏感性高，特异性强，方法简便第六节 多聚合物酶法多聚合物酶法HRP-多聚合物-抗体 一、Epos法Enhanced polymer one-step staining组织抗原一抗HRP多聚骨架EPOS 方法原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成HRP-多聚合物-特异性抗体。 步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵二、EnVision法Enhanced Labelled Polymer System原理：HRP -多聚合物-第二抗体组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步EnVisionTM方法特点：敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强：复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。 第七节基本操作步骤 抗原修复内源性过氧化物抑制正常血清封闭第一抗体第二抗体酶标记体 DAB- H2O2显色 第八节抗原定位及非特异染色 组织细胞 固定问题脱蜡不彻底内源性过氧化物内源性生物素 抗原 抗原弥散抗原异常表达共同抗原决定簇 特异性抗体 非特异吸附抗体不纯交叉反应 第二抗体 IgG交叉反应 二抗不纯标记物质量纯度标记水平 底物溶液 DAB H2O2 操作 复染抗体稀释度孵育时间 PAS洗涤 第九节 免疫酶方法评价 ESAVIMCA125INVVIMCKCD20VIMHPCPRPCNATOPOKi-67P21
