毛细管电泳技术及应用

毛细管电泳技术及应用电 泳在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作 用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现 象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁 移速率不同，可实现分离。1808年，Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白质混合液的 分离：发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；经典电泳利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无 法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管 进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本 变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析 技术毛细管电泳。毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：1.采用了25-100m内径的毛细管；2.采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加， 毛细管电泳的柱效远高于HPLC，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。分离过程© 电场作用下，毛细 管柱中出现：电泳现 象和电渗流现象。© 带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 © 阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； © 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； © 阴离子：两种效应的运动方向相反。电渗流 >电泳时,阴 离子在负极最后流出 ©除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也 同时被相互分离。毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分 离了24种阳离子；3.操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等； n一、CE基本原理n二、电渗现象与电渗流electroosmotic flown三、影响电渗流的因素n四、淌度mobilityn五、CE中的参数与关系式n六、影响分离效率的因素毛细管电泳理论基础毛细管电泳(CE)基本原理电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有 不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、 方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE = qE 阻 力：F = f故： qE = fq离子所带的有效电荷；E 电场强度； 离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数 ( 对于球形离子： f =6； 离子的表观液态动力 学半径； 介质的粘度； )所以，迁移速度：（球形离子）物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度 ：单位电场强度下的平均电泳速度。 q离子所带的有效电荷； E 电场强度； 离子的表观液态动力学半径 介质的粘度；电渗现象与电渗流electroosmosis and electroosmotic flow 1.电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电 荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界 面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时， 就会发生液体相对于固体表面 的移动，这种液体相对于固体 表面的移动的现象叫电渗现象 。电渗现象中整体移动着的 液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。 2.HPCE中的电渗现象与电渗流石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。3. CE中电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌 度和电场强度E。即电渗流 = E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即 = 00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流 = 0 E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算电渗流 = Lef/teoLef 毛细管有效长度； teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。CE中电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向负极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向正极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细 管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向正极。4. CE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式 流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流 速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽 较大）。5. CE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+ =电渗流 + +ef 阳离子运动方向与电渗流一致；- =电渗流 - -ef 阴离子运动方向与电渗流相反；0 =电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同 改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在CE中，控制电渗流非常重要。CE中影响电渗流的因素1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时， 电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电 荷特性不同，产生的电渗流大 小不同；3. 电解质溶液性质的影响（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密 度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大 ； pH电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；二、毛细管凝胶电泳capillary gel electrophoresis ，CGE将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。三、 胶束电动毛细管色谱（MEKC） Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC在电场力的作 用下，胶束在柱中 移动。2. 电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 > 电泳 ， 负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.色谱与电泳分离模式 的结合。3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强 的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；四、毛细管等电聚焦Capillary isoelectric focusing，CIEF4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6. 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7. 电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。五、毛细管等速电泳Capillary isotachophoresis ，CITP3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同 (=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该 区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中 离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4. 特点：界面明显，富集、浓缩作用；capillary isotachophoresis ，CITP在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。六、毛细管电动色谱Capillary electrokinetic chromatography ，CEC七、毛细管微乳电动色谱 (Microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)Watern-Octanen-OctaneSO3-SO3-OHOHOHOHOHNa+Na+WaterNa+SO3-WaterButan-1-olSDSSodium ionOHCE相关技术1.毛细管电泳柱技术毛细管是CE的核心部件之一早期研究集中在毛细管直径、长度、形状 和材料方面，目前集中在管壁的改性和 各种柱的制备。1) 动态修饰毛细管内壁 管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流，通常采用动态修饰和表面涂层两类方法。动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂，如加入阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)，能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向添加剂还有聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)等，甲基纤维素(MC)可形成一中性亲水性覆盖层。 2) 毛细管内壁表面涂层涂层方法有很多种，包括物理涂布、化学涂层。最常用的方法是采用双官能团的偶联剂，如各种有机硅烷，第一个官能团(如甲氧基)与管壁上的游离羟基进行反应，使其与管壁进行共价结合，再用第二个官能团(如乙烯基)与涂渍物(如聚丙烯酰胺)进行反应，形成一稳定的涂层此外还有将纤维素、PEI和聚醚组成多层涂层，亲水性的绒毛涂层(fuzzy)和联锁聚醚涂层。化学 键合物理吸 附3) 凝胶柱和无胶筛分CGE的关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺凝胶栓来进行DNA片段分析和测序。测定蛋白质和肽的分子量常用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-LPAGE)。如将聚丙烯胺单体溶液中的交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)浓度降为零，得到线性非交联的亲水性聚合物用作操作溶液，仍有按分子大小分离的作用，称无胶筛分。此法简单，使用方便，分离能力比CGE差。4) CEC的毛细管柱制备 包括开管和填充柱开管柱：键合色谱涂层毛细管柱，例如：将核糖核酸酶、己糖激酶、腺苷脱氨酶等固定到毛细管表面，构成一开管