第五章 遗传工程小鼠

第四章第四章 遗传工程小鼠遗传工程小鼠主讲教师：侯晓林 博士 北京农学院 教授转基因与转基因动物转基因与转基因动物转基因超级鼠转基因超级鼠 1982年，英国的自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实 验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠 受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠 比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。遗传工程动物明星 多利世界上第一只用已经分化的成熟的体细胞(乳腺细 胞)克隆出的羊遗传工程动物明星 乙肝小鼠持续表达乙肝病毒表面抗原的转基因小 鼠。 将乙型肝炎病毒基因注入小鼠受精卵，整合进基因组 ，让乙型肝炎病毒在小鼠体内生存，并代代相传 乙型肝炎的病因 发病机理及防治 药物筛选 疫苗验证遗传工程动物明星 荧光鼠取小鼠早期囊胚，注射转染了绿色荧光蛋 白基因的小鼠胚胎干细胞后植入代孕母鼠子宫内一、转基因小鼠技术的发展史转基因小鼠技术兴起于60年代 ，至80年代中期逐渐成熟。其中关键 的技术是实现外源基因的导入及整合 ，这一技术的发展到目前已经历了四 个阶段：1. 实现外源基因的导入。2. 实现外源基因的定点整合-基因打 靶。3. 实现外源基因的组织特异性表达。4. 实现外源基因的时间可控性表达。第一阶段：实现外源基因的导入1974年，Jaenisch等用显微注射法将SV40 的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的 肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明将外源 基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠 受精卵中的转移并能遗传给后代。在基因转移的方法上相 继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。SV40超级小鼠的建立 1982年，美国学者Palmiter将大鼠生长激素 基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只 生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级 小鼠”(supermouse)诞生了(Palmiter et al.,1982:Nature,Vol.300,December 16,1982)。“ 超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界， 科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞 相开展这方面的研究工作，因此，转基因小鼠技 术迅速发展，不断完善。第二阶段：转基因的定点整合。1987年，美国北卡罗莱纳大学 Smithies和犹他大学Capecchi领导的研究小组根据 同源重组的原理，实现了导入的外源基因的定点 整合，这一技术亦称为“基因打靶”(Gene targeting).基因打靶技术的应用，一方面可以使导 入的外源基因定点整合于人们希望整合的部位， 从而避免了外源基因随机整合对内源基因的影 响。另一方面，人们还可以利用基因打靶技术定 点灭活一个内源基因，亦称为“基因敲除”(Gene knockout)。因此基因打靶技术为在整体水平研究 某一基因的功能以及进行基因治疗开辟了新的途 径。转基因的组织特异性表达随着一系列组织特异性启动子（promoter ）的发现和应用，导入的外源基因逐步实现了 在特定组织细胞内的表达。这样就使得对转入 的外源基因功能的研究精确到了组织特异性表 达的水平. 转基因的组织特异性表达问题：表达时间能否控制？遗传工程动物制作的基本原理和技术 对 遗传物质（DNA）的体外施工 主要建立在基因水平上，因此也被称为基因工程/重 组DNA技术 相比于传统保种、育种技术的优势： 1、高度预见性 2、精确 3、高效率 4、打破自然界限制（时空、种属）基因工程动物 原理：分子遗传学 技术手段：分子生物学、微生物学 基本过程：体外构建杂交DNA(重组），导入活细胞， 发育为个体 结果：改变原有遗传性状，获得新品种/物种 意义：使基因操作走向整体动物水平从分子水平 改造动物/改变动物基因组，从整体水平（活体动物 ）观察效应基因工程动物 基因工程动物：通过基因工程技术/重组DNA，人为改 变遗传性状的动物 转基因动物：以实验方法将特定外源基因导入动物受 精卵或胚胎，使之稳定整合于染色体基因组，并能够 遗传给后代的一类动物（有别于嵌合体动物） 1、其所有细胞均整合有外源基因 2、其外源基因能够遗传给子代嵌合体 嵌合体在希腊神话中是指具有狮头、羊身和蛇尾的一种怪 物。种内嵌合体1965年 获得了小鼠的嵌合体后代1968年 获得了绵羊的嵌合体后代1974年 获得了大鼠、家兔的嵌合体后代1984年 获得了牛的嵌合体后代1987年 获得了猪的嵌合体后代 种间嵌合体1973年 小鼠与大鼠1980年 家养小鼠与野生小鼠1983年 牛与水牛1984年 绵羊与山羊嵌合体 哺乳动物嵌合体的生产方法1卵裂球聚合法将不同遗传性能而发育阶段相同或相近的胚胎卵 裂球聚合在一起获得嵌合体的方法，胚胎发育阶段在 8细胞至桑椹胚阶段较为理想。2囊胚注射法把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团细胞或EC 细胞、ES细胞直接注射到另一枚囊胚的腔隙中获得嵌 合体的方法。 嵌合体 嵌合体的生产效率低，种间嵌合体仅在少数动物上取 得成功，远缘动物嵌合体仍存在很大障碍。 通过嵌合方式可能会得到经济价值或观赏价值更高的 动物。 种间嵌合体技术也为拯救濒危动物提供一种方法。 特异性嵌合体技术若能使嵌入的细胞定向分化为嵌合 体的某一组织或某一器官，有极高的医学价值（人心 猪，真人耳鼠）。转基因动物 广义：对动物基因组的所有改动 狭义：以显微注射、反转录病毒介导、胚胎干细胞介 导等方式转入基因，获得新功能转基因动物 基因转移/基因打靶：以精确的基因替换技术获得新 基因，knock-in knock-out第一节、转基因小鼠转基因技术 转基因（狭义）原理和局限 1、细胞学原理：利用MII期卵母细胞无核膜、外源基因 易导入特点 2、胚胎学原理：利用雌雄原核融合之前雄原核易见特 点 3、分子生物学原理：随机整合 整合位点、表达效果的不可预期性早期胚胎-单细胞期受精卵受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成 一个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称 为全能性。随着分化发育的进程，转基因会分 布到各种组织细胞中去，包括生殖细胞，因此 ，转基因是可以遗传的。转基因技术 常用转基因技术手段 1、显微注射将外源基因直接注射到受精卵原核内，迄今应用较为普 遍和富有成就 对DNA片段大小无限制无需载体，可获无载体片段的转入目的基因 操作简单，周期短 各种随机整合结果：位点、多拷贝 可能不整合/游离体转基因技术2、电脉冲法 利用高压电短脉冲破坏细胞膜电位，造成细胞膜可逆 性穿孔，以便外源DNA进入细胞 瞬时转染/游离体、稳定转染/整合 DNA用量大、细胞容易死亡转基因技术3、逆转录病毒法 利用逆转录病毒侵入宿主细胞并整合于DNA的能力， 适合难以观察到雄原核的禽类受精卵 整合率较高 单拷贝单位点 可能得到嵌合体、逆转录病毒的潜在危害、可携带 DNA长度有限转基因载 体的构建启动子（promoter）拟表达基因编码序列(CDS).受精卵原核 DNA显微注射受精卵获得显微注射受精卵体外培养代孕母鼠输卵管移 植转基因 后鉴定PCR、southern印迹与野生型小鼠交配RNA印迹、RT-PCR 、western blot等转基因小鼠（原核注射法）构建过程第一法 雄原核显微注射法一、设计转基因载体一个完整的转基因构件应包括目的基因、启动子、加强子和 标记基因或报告基因。转基因构件的设计上还要考虑原核 载体序列的影响。 1、转基因调控序列 包括基因加强子和启动子。在启动子 的选择上可以如下两个方面进行考虑： （1）如需要得到外源基因全身一致表达的转基因品系出可 选择一个管家基因启动子。 （2）与一致表达相对的就是组织特异性表达，组织特异性 表达的启动子成分要复杂的多，将在后面的条件转基因中 介绍。二、雄原核显微注射法 常用转基因技术手段 1、显微注射将外源基因直接注射到受精卵原核内，迄今应用较为普 遍和富有成就 对DNA片段大小无限制无需载体，可获无载体片段的转入目的基因 操作简单，周期短 各种随机整合结果：位点、多拷贝 可能不整合/游离体一、DNA显微注射技术© 2003 John Wiley and Sons Publishers优点： 1.可靠性高、重复性好 2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高 3.导入DNA片段的大小和类型不受限制 4.转基因在代与代之间传递的稳定性好1980 PNAS 77,7380-7384缺点： 1.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响 2.可能会出现不希望的插入突变 3.装置和技术的花费大时间长1、注射前准备 用于显微操作的供体和受体母 鼠的处理程序（1）供体准备；（2）受体注射 前准备，即见下图。三、显微注射转基因小鼠模型的建立 （1）受体母鼠怀孕产仔。胚胎移植后2021天受体母鼠 产仔，正常情况下产仔数是移胚胎数的50%80%。 （2）断奶时子代鼠编号、剪下1cm左右的尾部组织，提 取DNA作整合检测。整合检测的方法有PCR、Southern 杂交、限制性内切酶检测，检测结果阴性淘汰，阳性 则作为G0代小鼠用于繁殖。通过显微注射法建立转基 因小鼠模型、获得10个G0代整合阳性小鼠是必须的。 （3）向C57BL/6或其他背景品系回交，F1代小鼠整合检 测阳性，则表示外源基因已稳定整合到转基因鼠的生 殖系中，这个外源基因是可能遗传的。（4）背景品系的纯化 采用基因导入法继续向 C57BL/6或其背景品系回交 ，即可建成以 C57BL/6为遗传背景或回交品系为背景的能稳 定遗传的近交系。 （5）胚胎冷冻保种 自F1代起，每一代都应冷 冻200枚以上胚胎，以防止繁殖过程中出现基 因丢失、繁殖障碍或其他原因造成转基因品系 断线。 （6）基因表达研究 自F1代以后要重点研究的 基因的表达，小鼠形态、功能的变化，组织病 理变化，最终建立医学动物模型。胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞，可被诱导分化为所有机体细胞类型；哺乳动物囊胚期内的细胞团分离出的尚未分化的胚胎细胞（囊胚期内层细胞），但不能发育为胎盘，不具有发育为完整个体的全能性它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。第二法、胚胎干细胞技术胚胎干细胞介导 将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达， 又不影响ES细胞的各种功能。 要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有 基因结构及功能没有影响或影响最小。 培育筛选无损囊胚植入代孕母体子宫发育为转基因动物， 也可整合外源基因的ES细胞注入受体囊胚腔中发育为嵌合 体，理想中的嵌合体小鼠C中，导入外源目的基因的ES细 胞最好发育成卵巢或睾丸。 对ES细胞的操作和培养容易 将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表 达，又不影响ES细胞的各种功能。 要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对 原有基因结构及功能没有影响或影响最小。转基因技术2、电脉冲法 利用高压电短脉冲破坏细胞膜电位，造成细胞膜可逆 性穿孔，以便外源DNA进入细胞 瞬时转染/游离体、稳定转染/整合 DNA用量大、细胞容易死亡转基因技术3、逆转录病毒法 利用逆转录病毒侵入宿主细胞并整合于DNA的能力， 适合难以观察到雄原核的禽类受精卵 整合率较高 单拷贝单位点 可能得到嵌合体、逆转录病毒的潜在危害、可携带 DNA长度有限转基因技术4、精子载体法利用受精作用 避免人工方法导致原核损伤 实践中成功率较低转基因技术基因定点突变（基因打靶） 利用DNA同源重组，即同源DNA之间相互配对并互换 的自然现象（自然状况下可增加自身和后代遗传多