微生物基本操作规范

食品微生物检验食品微生物检验规范操作基础培训规范操作基础培训1 1 清洗、消毒和灭菌操作清洗、消毒和灭菌操作福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室 2010.052010.05主要内容：主要内容：ا 1 清洗、消毒和灭菌操作ا 2 培养基的制备ا 3 采样和取、制样ا 4 接种、分离纯化ا 5 制片、染色及显微观察ا 6 实验室安全基础知识 § § 1 1 清洗、消毒和灭菌操作 清洗、消毒和灭菌操作1.1 玻璃器皿的清洗 1.1.1新购的玻璃器皿 碱性玻璃浸泡于mol/L盐酸浸泡过夜，中和玻 璃中的碱性物质。 1.1.2用过的玻璃器皿 污染的器皿，必须经过适当消毒， 污迹不能洗净时，可浸泡于洗液内。 1.1.3洗液的配制 称取重铬酸钾100g与1000mL水置大烧瓶中加热 搅拌溶化，待冷却后，将烧瓶置冷水中，慢慢加入浓 流酸250mL，并不断搅拌。 1.21.2 消毒、灭菌 消毒、灭菌v消毒（disinfection）：杀灭物体上病原微生 物的方法，但不一定杀死细菌芽胞。 v灭菌（sterilization）：杀灭物体上包括芽 胞在内的所有病原性和非病原性微生物的方法 。v防腐（antisepsis）：防止或抑制细菌生长繁 殖的方法，细菌一般不死亡。v无菌（asepsis）：不含活菌的意思。防止微 生物进入机体或物体的操作方法，称为无菌操 作或无菌技术。进行微生物实验、外科手术及 医疗技术操作等过程，均需进行严格的无菌操 作。 消毒灭菌的方法消毒灭菌的方法 l（一）物理消毒灭菌法l（二）化学消毒法 （一）物理消毒灭菌法（一）物理消毒灭菌法1.热力灭菌法 热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两 大类。在同一温度下， 后者效力比前者 为大，这是因为： （1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固； （2）湿热的穿透力比干热大； （3）湿热的蒸汽有潜热存在。水由气态变 为液态时释放出的潜热，可迅速提高被灭 菌物体的温度。 加热灭菌和加热消毒的方法加热灭菌和加热消毒的方法干热灭菌法 火焰灭菌法干燥加热空气灭菌法 高温灭菌 巴氏消毒法常压下 煮沸消毒法湿热灭菌法 间歇灭菌法常规加压灭菌法加压下 (高压蒸汽灭菌法)连续加压灭菌法干热灭菌法干热灭菌法1.焚烧：是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废 弃物品或尸体等。 2.烧灼：直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验 室的接种环、试管口等的灭菌。 3.干烤：鼓风干燥箱灭菌。一般加热至160 170经2小时。适用于高温下不变质、不蒸发 的物品， 如玻璃器皿、瓷器等。 湿热灭菌法湿热灭菌法l1.煮沸法：1个大气压下，煮沸的水温为100，一般细菌繁殖体煮沸510分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸1小时，才被杀死。水中加入2%碳酸钠，可提高沸点达105，促进细菌芽胞的杀灭。l 2.巴氏消毒法（pasteurization）:用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热61.162.8半小时即可，常用于牛奶和酒类等的消毒。 l3. 间歇灭菌法（郭霍氏蒸汽消毒）:将待灭菌的物品100加热1530分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。针对有点培养基和牛奶、糖等在100以上有效成分易被破坏的产品进行灭菌。 l4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅高压蒸汽灭菌器内进行的。通常采用纯饱和蒸汽压为103.4kPa，温度达121,维持1530分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。 适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服、耐高温塑料用品等物品的灭菌。 l在高压蒸汽灭菌前要确保高压锅中的所有冷空 气已经排空，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之 间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。l定期对灭菌效果进行监测和验证，可采用：Ø 物理监测法（留点温度计法、热电偶法）；Ø 化学指示剂法（化学指示胶带、指示卡等）；Ø 生物指示法（孢子悬液、孢子条带等）监控高压灭菌的效果。2.2.辐射辐射 利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或 化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广 。 1.紫外线：紫外线波长为200300nm时具有杀菌作用 ，其中以260nm最强。紫外线杀菌机理主要是作用 于细菌DNA，使同一条DNA 链上相邻的两个胸腺嘧 啶共价结合而形成嘧啶二聚体，因而改变DNA的分 子构型，干扰细菌DNA的复制与转录，导致细菌的 死亡或变异。紫外线穿透力差，故只适用于空气及 不耐热物品的表面消毒。 2.应用射线作食品表面杀菌，射线用于食品内部 杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再 用冷冻保藏，可使保存期延长。 3.3.滤过除菌滤过除菌采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子 ，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛 子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而 达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳 定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它 的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。 滤过除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒 素、抗生素、药液、空气等除菌。但是比细菌还小的 病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一 定的麻烦。 滤菌器的种类很多，目前常用的有蔡氏滤菌器、 玻璃滤器、薄膜滤器。 （二）化学消毒法（二）化学消毒法化学药物根据其抑菌或杀死微生物的效应分为 杀菌剂、消毒剂、防腐剂三类。1.凡杀死一切微生物及其孢子的药剂称杀菌剂；2.只杀死感染性病原微生物的药剂称消毒剂；3. 只能抑制微生物生长和繁殖的药剂称为防腐剂。但三者界限往往难以区分。化学药剂的效应与 药剂浓度、处理时间长短和菌的敏感性均有关系， 主要仍取决于药剂浓度。大多数杀菌剂在低浓度 下只起抑菌作用或消毒作用。它们的杀菌或抑菌原 理基本相同。实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂 列于下表 。类 别代 表*常用浓度*用 途作用机制醛类甲醛36%40%10%熏蒸空气(接种室、培养室) 发酵罐甲醛蒸汽灭菌组织标 本固定使蛋白质和酶 变性酚类石炭酸来苏尔3%5%3%5%1%2%室内空气喷雾消毒，擦洗被 污染的桌面、地面浸泡用过的移液管等玻璃器 皿(浸泡1h)皮肤消毒 (12min)破坏细胞膜， 使蛋白质变性醇类乙醇70%75%皮肤消毒(对芽胞及孢子无效 ) 或器皿表面消毒脱水，蛋白质 变性实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂实验室中常用的化学杀菌剂和消毒剂有机酸乳酸醋酸 苯甲酸 山梨酸 丙酸盐80%或0.33 1mol/L 35mL/m3 0.1% 0.1% 0.32%熏蒸空气(接种室、培养 室) 熏蒸空气 食品防腐剂(抑制真菌) 食品防腐剂(抑制霉菌) 食品防腐剂(抑制霉菌)破坏细胞膜和 酶类无机酸 碱类硫酸 烧碱NaOH 石灰水0.01mol/L 4% 1%3%适用于玻璃器皿浸泡病毒性传染病粪便消毒、畜舍消毒破坏细胞膜和 酶类氧化剂 高锰酸 钾 漂白粉 过氧化 氢 氯气 碘0.1%3%1%5%3% 0.21.0ppm2.5%皮肤、水果、茶具消毒 洗刷培养室、饮水及粪 便消毒(对噬菌体有效 ) 清洗伤口饮用水消毒皮肤消毒蛋白质或酶氧 化变性重金 属昇汞(HgCl2) 汞溴红(红 药水) 硝酸银 硫酸铜0.05%0.2%2%0.1%1.0% 与石灰水配成 波尔多液非金属表面器皿及组织 分离体表及伤口消毒新生儿眼药水 真菌、藻类杀菌剂，防 治植病蛋白质变性，酶 失活金属 螯合 剂8-羟奎啉硫 酸盐0.1%0.2%外用(清洗、消毒) 生化试剂缓 冲液的防腐 剂与酶的激活剂或 金属活性基结 合，使酶失活去污 剂新洁尔灭 (原液为5%季 胺盐)肥皂0.25% 1：1000 1：5000皮肤及器皿消毒 浸泡用过的盖片、载片皮肤清洁剂破坏细胞膜；使 蛋白质变性染料结晶紫2%4%体表及伤口消毒与细胞膜或细胞 质中核酸结合， 破坏其生理功能接种室、培养室空气熏蒸消毒接种室、培养室空气熏蒸消毒Ø甲醛熏蒸消毒法 （1）加热熏蒸按熏蒸空间计算，量取甲醛溶液，盛在小烧杯或白瓷坩埚内，用铁 架支好，点燃酒精灯，关闭室门。甲醛溶液煮沸挥发，酒精灯最好能在 甲醛蒸完后即自行熄灭。所需酒精的量要加以控制。 （2）氧化熏蒸称取高锰酸钾（相当于甲醛用量的1/2）于一白瓷坩埚或玻璃烧杯内 ，再量取定量的甲醛溶液，准备妥当后，把甲醛溶液倒在盛有高锰酸钾 的器皿内，立即关门。甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种强氧化剂 ，当它与一部分甲醛溶液作用时，由氧化作用产生的热可使其余的甲醛 溶液挥发为气体。甲醛溶液熏蒸后关门密闭保持12h以上。Ø硫磺熏蒸法称好硫磺粉，将其放在垫有几张废纸或火柴棍的白瓷坩埚或烧杯内 ，点火燃烧，密闭24h，硫磺燃烧前在室内墙壁、桌面、地上喷洒些水 ，使之产生的H2SO3杀菌力增强。为了防止H2SO3和H2SO4对金属腐蚀， 熏蒸前将金属制品妥善处理。影响消毒灭菌效果的因素影响消毒灭菌效果的因素l1.消毒剂的性质、浓度和作用时间：一般情况下浓度越 大，作用时间越长，杀菌效果越好。但95%的乙醇消毒 效果反不如75%为好，因为高浓度乙醇使细菌表面的蛋 白质迅速脱水而凝固，影响乙醇进入菌体内，减弱其杀 菌作用。 l2.微生物的种类与数量：同种消毒剂对不同微生物的杀 菌效果不同。如结核杆菌对酸、碱的抵抗力 比其他的 菌强；70%乙醇可杀死一般细菌繁殖体，但不能杀灭细 菌芽胞。因此，必须根据消毒对象选择合适的消毒剂。l3.环境中有机物的影响：消毒环境中如有有机物存在， 如血清、脓汁、痰、粪便等，可与消毒剂结合而影响杀 菌效果。 §§2 2培养基的制备培养基的制备 l培养基是指以液体、半固体或固体形式，包 含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖 或保持其活力的物质组成。由于各类微生物 对营养的要求不同，培养目的和检测需要不 同，因而培养基的种类很多。我们可根据某 种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类 型。 2.1 2.1 培养基的分类培养基的分类2.1.1根据培养基的组成来源不同来区分:l天然培养基;l合成培养基;l半合成培养基。天然培养基天然培养基天然培养基是指利用各种动、植物或微生物 的原料。如：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏 、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血 清等 u优点：营养成分丰富，培养效果好，来源广泛.u缺点：成分难以确切知道。合成培养基合成培养基l合成培养基是一类化学成分和数量完全 知道的培养基，它是用已知化学成分的 化学药品配制而成。l这类培养基化学成分精确、重复性强， 但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所 以它只适用于做一些科学研究，例如营 养、代谢的研究。 半合成培养基半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种 天然成分；或者在天然培养基中，加入 一种或几种已知成分的化学药品即成半 合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等 。这种培养基在生产实践和实验室中 使用最多。 l固体培养基；l液体培养基；l半固体培养基。2.1.22.1.2根据培养基的根据培养基的物理状态物理状态来区分来区分液体培养基液体培养基所配制的培养基是液态的，其中的 成分基本上溶于水，没有明显的固形物 ，液体培养基营养成分分布均匀，易于 控制微生物的生长代谢状态。 固体培养基固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂 即成固体培养基。常用作凝固剂的物质 有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常 用。固体培养基在实际中用得十分广泛 。在实验室中，它被用作微生物的分 离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生 物测定等。 半固体培养基半固体培养基把少量的凝