叶绿体色素的提取、分离、定性和定量分析

实验二 叶绿体色素的提取、分离、定性和定量分析一、试验目的1、通过实验加深对叶绿体色素理化性质的理解2、通过实验培养学生动手能力和实验分析能力3、通过对比阴生植物与阳生植物叶绿素a和叶绿素b的差异，了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相 关性。二、实验原理 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，它们以色素蛋白复合体形式存在于类囊体 膜上。1、溶解性：叶绿体色素溶于乙醇、丙酮等非极性溶剂中用乙醇或丙酮进行提取2、叶绿素分子可被光激发，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它从第一单线态返回基 态时可发射出红光量子，因而产生荧光。因为分子吸收的光能 有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比 被吸收光的波长要长。叶绿素荧光（暗红色）3、叶绿素是双羧酸的酯，可发生皂化反应（酯和碱反应）生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸盐（能溶于水），可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。4、在酸性条件下，卟啉环中央的镁离子可以被 H+ 取代，产生褐色的去镁叶绿素。叶绿素中的Mg2+也可以被其它金属离子，如Cu2+等取代，此时叶绿素仍保持绿色，但此种叶绿素的稳定性较强，常被用于浸渍标本中。-叶绿素的铜代反应5、通常植物中叶绿素a的含量是叶绿素b的三倍。阴生植物光补偿点，利用低光的能力较强，其与阳生植物在叶绿体色素的构成和含量上不同。不同叶绿体色素在可见光谱中具有不同的特征吸收峰，利用分光光度计在某一特定波长下所测得的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中的色素浓度。已知叶绿素a、b以及类胡萝卜素的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm、646和470n m,根据加以下关系式可计算出溶液中叶绿体色素的浓度及植物体中叶绿体色素的含量： 提取液 Ca=12.21A663-2.81A646（叶绿素 a 浓度）中色素 J Cb=20.13A646-5.03A663（叶绿素 b 浓度）浓度 CT=Ca + Cb（叶绿素总浓度）Cx,c= （1000A470-3.27Ca-104Cb） /229 （类胡萝卜素总浓度）单位：mg/L叶片中色素含量=色素浓度（mg/L）*提取液体积（L） /样品鲜重（g）或叶面积（m2）三、实验步骤（一） 提取和定性分析二） 叶绿体色素的定量分析1、用打孔器打取新鲜菠菜叶片和绿萝叶片，放入研钵中，加2ml80%丙酮和少许碳酸钙和石英砂，研磨， 再加入2ml丙酮继续研磨成匀浆，转移入离心管中，用丙酮4ml反复润洗研钵，全部液体转移入离心管中。2、将离心管于4000r下离心15min，上清液即为色素提取液，以80%丙酮为对照，于663、646、470nm 下测定吸光度（A663、A646、A470）。3、结果计算：根据原理部分给出的计算公式进行叶绿素含量的计算，列表比较分析两种不同植物叶绿体 色素构成的不同。菠菜与绿萝叶绿素的含量及对比项目菠菜叶绿萝叶样品面积（m2）Ca=12.7OD663-2.69OD645（mg /l）Cb=22.9OD645-4.68OD663 （mg /l）Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663（mg /l）Chla 含量（mg /m2）Chlb 含量（mg / m2）ChlT 含量（mg / m2）Chla/Chlb注意事项：为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进并注意叶绿体色素的避光保存。（1）二氧化硅的作用是使研磨更加充分、迅速；碳酸钙的作用是调节液体的pH,防止叶绿素被破坏保护 叶绿素不分解。（2）研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜。研磨要领是不能一下一下的砸，而是要用力的压。研磨 要迅速、充分。这是因为一是因为丙酮容易挥发；二是为了使叶绿体完全破裂，从而能提取较多的色素； 三是叶绿素极不稳定，能被活细胞中的叶绿素酶水解而破坏。（3）皂化反应时弱溶液浑浊，可放于35-40 度水域中加热摇动（ 4）所有操作动作要快