实验四无菌操作技术与细菌的简单染色

实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色一、实验目的1、熟练掌握无菌操作技术（从试管菌种 中转接微生物到新的试管培养基中）， 体会无菌操作的重要性；2、学习并掌握微生物的制片及简单染色 的基本技术。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色二、实验原理1、高温对微生物具有致死效应，因此在微生 物的转接过程中，一般在酒精灯火焰旁进行 ，并用火焰直接灼烧接种环（针、铲），以 达到灭菌的目的。2、简单染色：利用单一染料对菌体进行染色 的方法。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色二、实验原理发色集团：色原，赋予染料颜色特征 染料助色集团：能够形成盐，与细菌细胞结合使着色 。碱性染料：包括美蓝（亚甲基）、结晶紫、 染料 碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等酸性染料：酸性复红、伊红和刚果红等。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色二、实验原理微生物细胞在碱性、 中性及弱酸性溶液中通常 带负电荷，而碱性染料电离后部分带正电荷 ，很容易与细胞结合使其着色；当微生物细胞处于酸性条件下所带正电荷增加 时，可采用酸性染料着色。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色三、实验仪器与用具 超净工作台、接种环、酒精灯、火柴、试管架 、显微镜、擦镜纸、双层瓶、装有蒸馏水的 滴瓶等 四、实验材料与试剂 大肠杆菌（E.coli）营养琼脂培养基 枯草芽孢杆菌（B.subtilis）营养琼脂斜面 金黄色葡萄球菌（S.aureus）营养琼脂斜面实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色五、实验操作（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）1、手持试管左手：拿细菌斜面培养物和营养斜面右手：持接种环2、拔棉塞在火焰旁打开斜面培养物的试管棉塞，注意不能放在 桌面上，并将试管口在火焰上灼烧一下。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）3、取菌使用灼烧并冷却的接种环在细菌的琼脂斜面上 轻轻刮取。4、划线从下到上划一直线，然后再从其底部开始向上 做蛇形划线（或“之”字形）实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（一）无菌操作技术（用接种环转接菌种）5、塞棉塞6、灼烧接种环7、作标记使用记号笔在试管口部注明菌种名称、接种日 期和接种人姓名。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色五、实验操作 （二）细菌的简单染色 1、涂片在载玻片的中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操 作从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜 面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜（直 径约1cm）。 注意事项：1）载玻片要洁净无油迹； 2）滴生理盐水或取菌不宜过多； 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（二）细菌的简单染色 2、干燥 自然干燥 3、固定 涂面朝上，通过火焰23次。 固定的目的：1）使细胞质凝固变性，固定细 胞形状；2）使菌体牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫 手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色（二）细菌的简单染色 4、染色 滴加染液覆盖涂菌部位即可。 染色时间：吕氏碱性美蓝 1.5min；草酸铵结晶紫或齐氏石炭酸复红 1min 5、水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至图片上留下的水无色 为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻 片的一端留下，水流不宜过急、过大，以免涂片薄 膜脱落。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色五、实验操作 （二）细菌的简单染色 6、干燥用吸水纸吸取多余的水分，自然干燥或电吹风 吹干。 7、镜检涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。实验四 无菌操作技术与细菌的简单染色六、实验作业 1、根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。 2、在进行细菌涂片时应注意哪些环节？ 3、进行细菌制片时为什么要进行加热固定？在 加热固定时应注意什么？ 4、进行简单染色的目的及原理是什么？进行微 生物制片时是否都需要进行染色？为什么？