脱钙骨基质与左旋聚乳酸／聚磷酸钙纤维对骨髓间充质干细胞黏附作用的比较

脱钙骨基质与左旋聚乳酸聚磷酸钙纤维对骨髓间充质干细胞黏附作用的比较?2O6?2007年3月第23卷第3期ChinJTrauma,March2007,Vo1.23,No.3?骨组织工程?脱钙骨基质与左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维对骨髓间充质干细胞黏附作用的比较李强何清义许建中曾琳罗飞周强【摘要】目的探讨左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维(PLLA/CPPf)与同种异体的脱钙骨基质(DBM)对BMSCs黏附作用的差异,为构建组织工程骨提供理想的支架材料.方法用扫描电镜观察两种支架材料的孔径;通过测吸水率比较其亲水性.将普通培养瓶培养的第3代BMSCs分别成骨诱导培养1周后,在体外分别与PLLA/CPPf和同种异体的DBM复合构建组织工程骨,于构建后10h计算细胞黏附率,并用扫描电镜观察比较两种支架材料对BMSCs黏附作用的差异.构建后每天在相差显微镜下观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况,构建后第l0天再行扫描电镜观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况.结果DBM的孔径明显较PLLA/CPPf的大,孔隙率高,体外构建后10hDBM组的细胞黏附率为(91.3±8.2)%,PLLA/CPPf组为(82.2±7.7)%,两者之间差异具有统计学意义(P<0.05).DBM组于术后第3天网孔间出现细胞外基质,且随着时问的推移,基质变得稠密,而PLLA/CPPf的细胞外基质鲜见;第l0天的扫描电镜也证实DBM组的细胞在支架材料上数量多,且细胞外的基质分泌较多.结论DBM较PIJ_A/CPPf更适于BMSCs的黏附生长,是理想的组织工程支架材料.【关键词】骨基质,脱钙;问充质干细胞;细胞黏附;左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维;骨组织工程Comparativestudyofadhesivenessof!lmAmimchatstemcellstotwokindsofscaffoldsofbonelisslleaIg.mnginvitro12Qing,HEQing-yi,XUJian-zhong,ZENGLin,LUO,ZHOUQing.OrthopaedicResearchCenter,SouthwestHospital,theMilitaryMedicalUn&ers,Chongqing400038,Ch/naCorrespondingauthor:XUJian-zhong.TeZ:00862368754164【Abstract】ObjectiveToexplorethedifferencesofadhesiveeffectsofhumanmesenchymalstemceHs(MSCs)onallogeneicdecalcifiedbonematrix(DBM)andcalciumpolyphosphatefibre/poly(Llac-ticacid)(PLLA/CPPf)inordertoaffordanidealscaffoldforbonetissueengineefing.MethodsThediameterandrateofthehohintheDBMandPI.I.A/CPPfwereobservedunderscanningelectronmicroscop(SEM).Thehydrophilicityofbothscaffoldswasevaluatedbycalculatingwaterabsorptionrate.ThethirdgenerationofMSCswasculturedonthetwokindsofscaffoldmaterials.andtheadhesiverateswerecalcdated10hourslater.ThegrowthsituationofMSCsonthetwoscaffoldswasobservedunderphasecontrastmicroscopeeverydayandwithSEM10daysafterconstruction.ResultsThediameterandtherateofthehohofDBMweregreaterthanthoseofPI.I.A/CPPf.theadhesiveratesofDBMandPILA/CPPfwere(91.3±8.2)%and(82.2±7.7)%respectively,therewassignificantdifferencebetweenthetwogroups.MorematrixwasobservedonDBMthanonPI.I.A/CPPfunderphasecontrastmicro-scopeandSEM.ConclusionDBMiSmoresuitableforadhesivenessandgrowthofMSCsthanPI.I.A/CPPf.Itisanidealscaffoldmaterialforbonetissueengineering.【Keywords】Bonematrix,decalcified;Mesenchymalstemcells;celladhesion;Poly(Llacticacid)Calciumpolyphosphatefibre;Bonetissueengineering基金项目;国家自然科学基金资助项目(30300357);国家高技术研究发展计划重大资助项目(2003AA205020)作者单位:4037重庆,第三军医大学附属西南医院骨科,全军矫形外科中心李强(Email:lqlqlO1126.com,现在解放军第九十八医院南京军区显微骨科中心,313000)通讯作者:许建中,电话:023687541642007年3月第23卷第3期ChinJTrauma,March2007,Vo1.23,No.3骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,BMSCs)因具较强的自我增殖的潜能,是目前认为最理想的骨组织工程种子细胞之一¨.而决定骨组织工程修复骨缺损疗效的另一大关键因素支架材料的种类繁多,各有利弊.因此,筛选出适于BMSCs黏附生长的支架材料是提高组织工程骨修复骨缺损疗效的关键所在.研究表明,脱钙骨基质(DBM)和左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维(PLLA/CPPf)分别是天然和人工合成的骨组织工程理想的支架材料一.笔者通过比较该两种支架材料对BMSCs的黏附生长作用的差异,以期为BMSCs筛选出更为适宜的支架材料.1材料与方法1.1主要试剂和仪器淋巴细胞分离液(北京华美生物工程公司),DMEM(Dulbecco'smodifiedeaglemedium)细胞培养基和优等胎牛血清(美国Hyclone公司),胰蛋白酶(美国Sigma公司),乙二胺四乙酸(美国Sigma公司),地塞米松(美国Sigma公司),维生素C(美国Sigma公司),B甘油磷酸钠(美国Sigma公司),AMRAY一1000B扫描电子显微镜(美国Amray公司),Laica相差显微镜(德国LAICA公司).1.2方法1.2.1BMSCs的分离与培养:骨髓来源于健康志愿者,参照文献5的方法,于髂后上嵴穿刺,用内含肝素钠200U,等渗盐水20IIll注射器抽取骨髓15IIll,沿管壁缓慢注入4支含5IIll淋巴细胞分离液的10IIll离心管,进行梯度离心(2000r/min×20rain),仔细吸取中间交界面云絮状薄层,加入DMEM培养基洗涤1次(1500r/min×5min),加入DMEM完全培养基(含体积分数15%胎牛血清,青霉素钠100U/ml,链霉素100U/mO,吹打计数,以1×10/cm的密度接种于23瓶250ml玻璃培养瓶中.48h首次换液,以后第3天全量换液.孵育箱内培养条件:37C,体积分数5%CO,饱和湿度.1.2.2BMSCs的传代与诱导培养:待细胞长到瓶底80%面积时加入2.5g,/L胰蛋白酶5IIll,消化35min,加入DMEM完全培养基中止消化,移人50IIll离心管,离心(1500r/min×5min)后弃上清液,加入DMEM完全培养基,吹打计数,以1×10/em的密度传代培养,收集第3代细胞以1×10/em待用.将第3代BMSCs以1×10/瓶的密度接种于8个250ml的普通培养瓶,加入诱导培养基(含体积分数15%胎牛血清的DMEM,添加地塞米松10mol/L,维生素C50g/ml,B一甘油磷酸钠10mmol/L,青霉素钠100U/ml,链霉素100U/m1),孵育箱内继续孵育.1.2.3两种支架材料制备:PLLA/CPPf制备:参照Freed等熔铸颗粒沥取法.在超净条件下,将氯化钠颗粒(直径300450)3860g,聚磷酸钙纤维(长度10mm,直径15m)0.483g,牛I型胶原0.010g掺人含L聚乳酸(平均相对分子质量1.0×10)0.262g的三氯甲烷溶液中,充分混匀;用预制模具熔铸成型;37三氯甲烷挥发48h,期间适时脱模;干燥器内真空抽提溶剂;双蒸水反复萃取样品中氯化钠颗粒;室温下自然干燥24h,干燥器内真空干燥48h,经冻干机处理24h,纸塑包装密封,环氧乙烷消毒,最后保存于真空干燥器内.材料呈白色多孔状,直径11mm,厚4mm(图1).DBM制备:采用捐献人的松质骨先制成大小为10mm×5mm×5mm骨条,再依次脱钙,脱蛋白,脱脂.将洗涤后的DBM控干后,用无菌塑料包装袋包装,置一50超低温冰箱预冻,再置人真空冷冻干燥机内在一50下维持30min,抽成真空3h,以间隙手动加热法除去余下的水分,1h关机,进行分零(12g)包装,用co照射消毒,保存于一20箱内备用(图2).1.2.4扫描电镜观察:使用前分别将相同体积的两种支架材料置于6孔培养板内,用优等胎牛血清浸泡湿化.取等体积约5mm×5mm×5mm两种材料锐刀横切,真空干燥,横截面喷金,用AMRAY一1000B扫描电镜观察其横截面超微结构,并随机选择不同区域,游标卡尺测量孔径范围.1.2.5亲水性测定:取大小不同的两种材料各3块,置于100ml0.1mmol/L的PBS(pH7.4,37oC)中,7d后取出样品,用滤纸吸净样品表面水分,称其重量,用下面公式计算:吸水率=(吸水后样品重量一吸水前样品重量)/吸水前样品重量×100%,取3个结果的平均值.1.2.6两种支架材料的组织工程骨的体外构建:BMSCs诱导后第7天,消化,离心后弃上清液,加入DMEM完全培养基,调整至适当体积后吹打计数,以1×10/ml的密度于超净台内向两种材料滴加细胞悬液1ml,以恰好浸湿整个组织块为宜.孵育箱内孵育10h,按静置接种法等待细胞贴壁.10h后将两组6孔板内的支架材料取出,每孔内留1块备用.置于另两个空的6孔板内,沿6孔板内壁缓慢加入诱导培养液10IIll,以恰好浸没组织块为宜.孵育箱内继续培2007年3月第23卷第3期chinTr丛Q,:养.隔天换液,并于构建后每天在相差显微镜下动态观察细胞在两种支架材料上黏附生长情况.1.2.7细胞黏附率的测定:向用于构建的两6孔培养板内加入2.5g/L胰蛋白酶5ml,消化35min,加入DMEM完全培养基中止消化,离心(1500r/minx5rain)后弃去上清液,加入DMEM完全培养基,调整至适当体积后吹打计数,按下列公式计