原位杂交试剂配方

一、储备液：1、20XSSCNaCl175.3g枸橼酸钠 88.2g 双蒸水加至 1000ml配制方法：先将 NaCl 和枸橼酸钠溶至 800ml 左右双蒸水中，用浓 HCl 调2、IMMgCl2 MgCl2 6H2 双蒸水PH至7.0补水至1000ml,高压灭菌备用。203g至 1000ml咼压灭菌后备用。3、5M NaClNaCl292.2g双蒸水至1000ml咼压灭菌后备用4、IMTrsHCl（PH8.0）Tris60.55g浓 HCl （约）21ml双蒸水至 500ml配制方法：先将Tris溶解于400ml左右双蒸水中，缓慢加入浓HCl约21ml 至PH8.0，待溶液冷至室温，补水至500ml，高压灭菌备用。5、0.5MEDTA （PH8.0）EDTA93.05g双蒸水至 500ml配制方法：先将EDTA溶解于约400ml双蒸水中，加10g左右NaOH调PH 至8.0，（调PH至8.0前EDTA不溶解），补水至500ml，高压灭菌备用。6、去离子甲酰胺离子交换树脂11g甲酰胺110ml配制方法：将离子交换树脂与甲酰胺混合，室温下搅拌30分钟，分装小管， -20 °C保存。7、Denhardt 液（50X）聚蔗糖（Ficoll400型）5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白5g双蒸水加至 500ml二、工作液1、Buffer I(PH7.5)1M Tris HCl50ml n|lJ5M NaCl15ml100mMTris-HCl加双蒸水至 500ml150nMNaCl2、Buffer III (PH9.5)1M Tris HCl25 mln|J5M NaCl5 ml100mM Tris HCl100mM NaCl50mM MgCl21M MgCl2双蒸水3、Buffer W(PH8.0) 1M Tris HCl0.5M EDTA 双蒸水加至 三、消化液12.5ml至 250ml2.5ml0 5ml100mMTris-HCl250ml1mM EDTA1、蛋白酶KA 液 一200mMCaCl2：双蒸水0.22g 至 10mlB 液一10mM Tris HCI (PH7.4) 2mMCaCl2：TrisA液 双蒸水2.12g1ml至 100ml配制方法：将Tris溶解于约80ml双蒸水中，加入A液(200mMCaCl2)1ml 后，用HC1调PH值至7.4，双蒸水补液至100ml，高压灭菌。C液：称取蛋白酶K1ml，加B液20ml，溶解后置37°C60分钟，分装小管，-20°C 保存。2、链酶蛋白酶(20mg/ml)取 1M Tris HCl 取 0.5M EDTA 取 5M NaCl 链酶蛋白酶 双蒸水加至1.5ml10 ml3 ml0.3mg150ml配制方法：将该酶的粉末溶于上述溶液中，于37 C孵育1小时，分装小管, -20 C保存。四、杂交液4XSSC50%去离子甲酰胺1 X Denhard 液 0.5mg/ml ssDNA 双蒸水 探针五、显色液：取 20X SSC50ul取 100%去离子甲酰胺125ul取 50X Dendard 液5ul取 10mg/ml ssDNA12.6ul57.5ul0.21ng/ml1、NBT/BCIP 液(1) 将10mgNBT溶于200ml二甲基甲酰胺中。(2) 于 37C加入 1ml 底物缓冲液(50mmol/L Tris HCl PH=9.5，100mmol/L NaCl 1mmol/L MgCl2 后，滴入)。(3) 将5mgBCIP溶于200ml二甲基甲酰胺中，然后慢慢加入上述溶液中， 置-20 C保存。(NBT:氯化氮四唑蓝，BCIP： 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐)