乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法

乳酸菌活菌数量检测方法一菌落计数法本方法适用于乳酸菌制剂及配合饲料中有效活菌数和杂菌率的测定。按照国家标准GB/T14699.1进行抽样，获得样品200g，分装于两个无菌、干燥的玻璃瓶中，贴上标签，注明产品名称、批号、取样日期等信息。一瓶供检验用，一瓶密封保，以备复查。一、测定原理：乳酸肠球菌用肠球菌琼脂培养基，杂菌用营养琼脂培养基；培养后利用平板菌落计数法进行计数。二、培养基与缓冲液配方：（1）营养琼脂培养基，每L蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂18.0g水稀释至1000mlPH7.07.4（2）肠球菌琼脂培养基，每L蛋白胨20.0g蔗糖5.0g葡萄糖5.0g乳糖5.0g酵母膏5.0g氯化钠4.0g乙酸钠1.5gVc0.5g琼脂17.0g水稀释至1000mlPH6.57.0（3）PH6.8磷酸缓冲液配制方法取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀即得。三、样品处理：（1）乳酸菌纯品制剂样品测定乳酸菌纯品制剂时，取样量为1g,溶解到100ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为100:1。（2）配合饲料样品测定饲料样品时，取样量为25g，溶解到225ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为10:1。四、有效活菌数、杂菌数的测定：（1）本方法采用平板菌落计数法（2）操作方法：1. 取磁力搅拌棒装入500ml三角瓶中，再量225mlPH6.8的磷酸缓冲液一并装入三角瓶中灭菌备用。纯品制剂量取缓冲液100ml。2. 取25g饲料样品放入三角瓶中，在磁力搅拌器中震荡混匀5min后，再放到摇床上37°C,150转/分，充分震荡45min,混匀成1：10稀释液。纯品制剂样品量为lg,混匀成1：100稀释液。3. 在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释。用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀（注意每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀）。4. 按上述操作顺序，做10倍比稀释，纯品制剂推荐稀释到10-8，配合饲料推荐稀释到10-4。5. 选择4个适宜稀释度，吸取该稀释度的液体10ul滴于灭菌平皿上，每个稀释度做3个平行。（注意分三点滴，便于液体充分散开）置于烛缸中37C培养36h后，计数菌落。（3）计算公式：1、有效活菌数：a. 计算出平皿同一稀释度3个平行组的菌落平均数。产品活细胞数=菌落平均数X稀释倍数X102、杂菌率：杂菌率（）=杂菌数三（有效活菌数+杂菌数）X100%注只对乳酸菌纯品制剂进行评定，对配合饲料不采用这个指标。