菌酶协同发酵豆粕工艺的优化

菌酶协同发酵豆粕工艺的优化11-01豆粕因其富含蛋白质，被广泛应用为饲用蛋白原料，但直接饲喂蛋白质生物转化 率较低，而导致其转化效率低的原因是在于抗营养因子的存在。抗营养因子不仅破坏 了饲料本身的营养价值和可利用效率，还大大降低了家禽的生产性能。因此需要将豆 粕中大分子蛋白转变成肽类物质和氨基酸等小分子物质，进而提高饲料蛋白的利用 率。酶解法和微生物发酵法是现在被广泛用于处理豆粕的两种方法。酶解法利用蛋白酶将大分子蛋白分解为小分子物质。其具有肽类物质含量高、免 疫活性强等特点，但在酶解过程易产生苦味物质，影响饲料产品的适口性。微生物发 酵法是通过发酵产生的蛋白酶发挥作用，此外在发酵过程会产生大量有机酸及香味物 质，对于改善饲料适口性，调节动物肠道健康具备积极意义，但单一的微生物发酵 法，蛋白酶的量较低，无法满足实际生产需求。菌酶协同发酵即在酶解工艺的处理下加入一定量的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌、甚 至霉菌等益生菌进行发酵，这些益生菌在发酵过程会产生多种香味物质，可以对饲料 产品的苦味起到调节作用。同时也可以克服单独利用微生物发酵产酶不足的问题，这 对于饲料的制备具有重大意义。而相较于其他益生菌，乳酸菌作为发酵菌种具有独特 的优势，它能够利用饲料中的糖代谢生成乳酸及其他各种有机酸，降低饲料的pH值，从而发挥抑菌作用，延长饲料产品的保质期，同时发酵产生的多种有机酸也增加 了饲料的营养性和适口性。本研究采取菌酶协同发酵法制备豆粕饲料。选用了产酸量高的植物乳杆菌作为发 酵菌种，同时选用了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶3 种蛋白酶制剂对豆粕进 行酶解，综合考虑发酵豆粕的小肽含量和有机酸含量的变化情况，对菌酶协同发酵豆 粕的工艺进行了优化。1材料与方法1.1菌株植物乳杆菌 DY6 ( CCTCC2017138 )、副干酪乳杆菌 DY2(CCTCC2017303)、鼠李糖乳杆菌 DY4(CCTCC2017279)、乳酸片球菌 DY5(CCTCC2017280)，保藏于中国典型培养物保藏中心；植物乳杆菌 DY1和鼠李糖 乳杆菌DY3，为实验室保藏。1.2主要试剂乙酸钠、K2HPO4、MgSO47H2。、MnSO44H2O、柠檬酸三铵、豆粕、酸 性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，购自山东和实集团有限公司；H2SO4、 ZnSO4、CUSO4、三氯乙酸、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒。1.3培养基MRS培养基(g/L):胰蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母浸出粉4.0，葡萄糖 20.0 , K2HPO4 2.0 ,柠檬酸三铵 2.0 ,醋酸钠 5.0 , MnSO4- 4 H2O 0.58 , MnSO4- 4H2O 0.25 吐温-80 1ml ,蒸馏水 1 l,pH6.36.5 ,1x105Pa 灭菌 30min。1.4仪器与踽SHP-300FE，智能生化培养箱上海三发科学仪器有限公司； PL2002电子天 平，METTLER TOLIDO公司；5804 R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；5424 台式高速离心机，德国Eppendorf公司；高效液相色谱仪chromaster ,日本日立 公司；GeIDoc凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司。1.5实验方法1.5.1菌株活化将实验室保藏菌种按照体积分数为1%的接种量接种到 MRS培养基，37 °C活 化24h,按照同样的方式活化23代，继续于MRS培养基中培养，得到乳酸菌的 菌液。1.5.2豆粕固态发酵将风干的豆粕、水、糖蜜、蛋白酶以及对数期的植物乳杆菌菌液按不同的的配比 混合均匀后置于经无菌处理的自封袋中，封口置于3 7C培养箱中发酵48h。1.5.3发酵菌株的筛选将风干的豆粕、水、糖蜜、及对数期的乳酸菌菌液按(所述水的加入量占豆粕总 质量的50%、糖蜜原液的加入量占豆粕总质量的 3%、菌液接种量占豆粕总质量的 5%)比例混合均匀后置于无菌处理的自封袋中，37 C培养箱中发酵48 h°55C烘 干、粉碎，测定样品中小肽、有机酸、总酸含量。1.5.4蛋白酶的选择将风干的豆粕、水、糖蜜、及不同的蛋白酶按（所述水的加入量占豆粕总质量的 5 0%、糖蜜原液的加入量占豆粕总质量的3%、蛋白酶加入量占豆粕总质量的1 %）比例混合均匀后置于无菌处理的自封袋中3。培养箱中培养48 h,55烘干、粉碎，测定样品中小肽含量。1.5.5菌酶协同发酵工艺优化1.5.5.1豆粕菌酶酵解的方法将风干的豆粕、水、糖蜜、蛋白酶及对数期的乳酸菌菌液按（所述水的加入量占 豆粕总质量的50%、糖蜜原液的加入量占豆粕总质量的3%、菌液接种量占豆粕总质 量的5%、蛋白酶2500U/g ）比例混合均匀后置于无菌处理的自封袋中，37 。培养 箱中发酵48 h。1.5.5.2菌液接种量对发酵豆粕的影响选取最佳菌株和蛋白酶，控制水、糖蜜及蛋白酶的添加量不变，分别接种质量分 数为1%、2%、3%、4%、5%的菌液37。发酵48h,55°C烘干、粉碎，测定样 品中小肽含量和有机酸含量。1.5.5.3加酶量对发酵豆粕的影响控制水、糖蜜、及菌液的添加量不变，分别添加 125、625、1250、1875、 2500U/g的蛋白酶37C发酵48 h,55C下烘干、粉碎，测定小肽含量和有机酸含 量。1.5.5.4发酵制度对发酵豆粕影响控制水、糖蜜、蛋白酶及菌液的添加量不变，分别设置发酵温度为30、37、40、45 C,发酵48h,55 C烘干、粉碎，测定小肽含量和有机酸含量。1.5.5.5发酵时间对发酵豆粕影响在基础发酵条件上，控制其他因素不变，分别设定 0、12、24、36、48、60、 72 h,经烘干粉碎后测定小肽含量和有机酸含量。1.5.6正交实验发酵工艺优化采用4因素3水平正交试验，共设9个处理，每个处理3个重 复，选择接种量、酶添加量、处理温度和发酵时间4个因素进行正交试验，因素水平 见表1,经烘干、粉碎后测定小肽含量和有机酸含量，随后筛选出较优组合。表1发酵工艺的筛选因素与水平Table 1 Screening factors and levels of rermentation process水平因素温度博量g-） 接种量/% 发障时间/h1351 2503362311 379443402 5005601.5.7发酵豆粕指标测定1.5.7.1小肽含量的测定采用方乐等的方法测定发酵前后豆粕的小肽含量。1.5.7.2粗蛋白含的测定称取1 g豆粕样品，0.2 g CuSO4 ,6g K2SO4混合均匀放入消化管中，加入 H2SO4 10 ml,将消化管放到消化装置上消化（4201, 2h）,将消化好的样品用 凯氏定氮仪测定。1.5.7.3总酸含的测定发酵后的豆粕进行烘干粉碎，每55 g样品加50mL的去离子水，用旋涡振荡 仪振荡15min , 6000r / min离心5min,取10 mL上清液，加入40 mL蒸馏 水，滴加3滴酚酞指示剂，用标定过的0.1 mol/ L NaOH滴定至微红。按公式计 算总酸质量分数L（折算成乳酸）：(1)S = 33-况顷 X90.W X 1001 000 x m式中：L,总酸质量分数，%; c, NaOH溶液的浓度，mol/ L; V，样品滴定 消耗的NaOH体积，mL;Vo空白滴定消耗的NaOH体积，mL; 90.08，乳酸 的摩尔质量，g/ mol;m,样品质量，g。1.5.7.4蛋白质体外消化率的测定采用李清晓等的方法测定发酵前后豆粕蛋白的体外消化率如公式。D/%- m ix 100(2)式中：D,蛋白质体外消化率，%; m1未酶解粗蛋白质量，g； m2酶解后粗蛋 白质量，g。1.5.7.5有机酸含的测定取1 g豆粕于50ml离心管中，加入10 ml去离子水，旋涡振荡15min , 10000r / min离心5 min，取上清，经0.22 pm滤膜过滤后，进行液相检测。1.5.7.6豆粕大分子蛋白降解情况分析称取1 g豆粕并添加10 ml浓度为0.2 mol/ L NaOH ,混合均匀并搅拌 15min，于10000r / min离心6 min，吸取上清液1 ml ,稀释10倍后作为样品。 取50pL样品液，加10pL蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min , 12000r / min离心5 min，取上清10pL上样，分析豆粕大分子蛋白降解情况。2结果与分析2.1发酵菌株的选择2.1.1小肽含量分析菌株图1不同菌株发酵后对小肽含量的影响未经乳酸菌发酵的豆粕原料小肽含量为 33.09 mg/g,由图1可知，经过不同 菌株发酵后小肽含量都有所上升，其中经副干酪乳杆菌 DY2发酵后的豆粕中小肽含 量为38.33mg/g,经植物乳杆菌DY6发酵后的豆粕中小肽含量为36.68 mg/ g,与对照组相比，小肽含量分别提高22.3%、18.5%。但总体来看，单纯用乳酸菌 发酵豆粕，小肽含量提高较少。2.1.2有机酸含量分析豆粕经过不同乳酸菌发酵后的产酸情况见图2,由图可知经不同菌株发酵后，植 物乳杆菌DY6总酸质量分数最高，为2.3%，而饲料添加剂中，酸化剂的添加量一般 在0.025 %3%，因此植物乳杆菌DY6优异的产酸性能可以替代或者部分替代饲料 中酸化剂的使用。另外，植物乳杆菌DY6发酵产物中有机酸种类丰富，其中的乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸都具有改善饲料适口性和调节动物肠道菌群的作用。综合 其产酸情况和分解蛋白情况，选取植物乳杆菌DY6为发酵菌株。12叫g乳酸=乙酸饷拧密酸"苹果酸一总酸n 2.5DYI DY2 DY3 DY 4 DY5 DY 6 乳酸菌菌株图3不同菌一株发酵后对有机酸和总酸含量的影响2.2蛋白酶的选择选用不同的蛋白酶在其合适的水解条件下处理豆粕，酶解后小肽含量见图3。酸性蛋白沌碱性蛋白购中性蛋白晦豆粕未姓理蛋白酶种矣图3豆粕经不同蛋H酶酶解后小肽含量豆粕经蛋白酶处理后，小肽含量显著提高，远高于单纯利用乳酸菌发酵，其中利 用中性蛋白酶处理后小肽含量最高，达 104.25 mg/g,比对照组小肽含量提高了 215%，因此选取中性蛋白酶进行菌酶协同发酵。2.3菌酶协同发酵豆粕工艺探究2.3.1菌液接种量对发酵豆粕的影响菌液接种量对发酵豆粕的影响见图4，小肽含量随菌液接种量的上升而提高，在 接种量为5%时趋于稳定。其中乳酸、丙酸在接种量5%条件下含量最高，乙酸含量 变化不明显，而柠檬酸在接种量2%的条件下含量最高，综合小肽含量和产酸情况， 最终选取5%的接种量为最适菌液接种量。图4菌液接种量对有机酸和小肽含量影响2.3.2加酶量对发酵豆粕的影响由图5可知，当加酶量小于1250 U/g时，小肽含量随加酶量的增加而提高， 在加酶量为1250U/g的时候小肽含量趋于稳定。而在加酶量为1250 U/g时乳酸、 丙酸含量最高分别达到了 1.07mg/g和3.34 mg/g,另外柠檬酸、乙酸含量适图5酶添加量对有机酸和小肽含量影响2.3.3发酵温度对发酵豆粕影响如图6所示，发酵温度401条件下小肽含量最高，为109.78 mg/g,在35、37°C条件下小肽含量差别不大，可见 40适合中性蛋白酶酶解，说明相对较高 的温度可使得中性蛋白酶的酶活增强。而有机酸含量在37C最高，其中乳酸含量最高，符合植物乳杆菌在 37C生长最佳的情况°40C的发酵温度下，虽然小肽含量 高，但其有机酸含量处于较低水平，因此综合小肽含量和有机酸含量，确定最适发酵 温度37 C。I.功乳酸吵 乙