流式细胞术样品制备技术(完整)讲课稿

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM 技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：取材：取手术或活检组织必须具有代表性， 如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜； 一般在室温1 个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储； 再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析； 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。第 1 节 样本单细胞悬液的制备方法一 新鲜实体组织样本的制备FCM 对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序， 但实际操作中总会出现这样或那样的问题。 在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时， 应尽量减少对细胞的这种影响。 目前常用的分散组织细胞的方法有如下 3 种。（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3 方面： 可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等； 可以水解组织间的粘多糖等物质；可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。 酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键； 弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。 不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。2 注意事项： 酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；要注意酶的使用浓度和消化时间；要注意酶活性的 PH 值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等； 要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。3 方法学程序（ 1） 将适合于酶消化的组织置于离心管中；（ 2） 将选好的酶溶液 1-2ml 加入盛有被消化组织的试管中；（ 3） 一般消化 20-30 分钟（恒温 37或室温），消化期间要间断振荡或吹打；（ 4） 终止消化，收集细胞悬液，以300 目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。（二）机械法机械法分散实体组织包括： 用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织， 用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用 300 目尼龙网滤出单细胞悬液； 采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。1 剪碎法： 将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水； 用剪刀将组织剪至匀浆状； 加入 10ml 生理盐水；用吸管吸取组织匀浆，先以100 目尼龙网过滤到试管中；离心沉淀 1000prm,3-5min ，再用生理盐水洗3 遍，每次以低速（沉淀去除细胞碎片；以 300 目尼龙网滤去细胞团块；细胞用固定液固定或低温保存备用。500-800prm ）短时离心2 网搓法 将 100 目， 300 目尼龙网扎在小烧杯上；把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，组织搓完；收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm， 2 分钟；固定细胞或低温保存备用。边搓边加生理盐水冲洗，直到将3 研磨法准备一只 70ml研磨器。先将组织剪成1-2mm3 大小组织块；放入组织研磨器中加入1-2ml 生理盐水；转动研棒，研至匀浆；加入 10ml 生理盐水，冲洗研磨器；收集细胞悬液，并经300 目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 prm ， 1-2 min ，再以生理盐水洗 3 遍，离心沉淀；固定或低温保存细胞悬液，备用。（三）化学处理法1 作用原理化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。2 试剂的配制0.2%EDTA配制：称 EDTA0.2g，加入Hank s 液100ml ，封装高压消毒。置0-4 保存；胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（ pH7.0 ） 200ml ，浓度0.125% ， EDTA 0.2g加PBS（ pH7.0） 100ml ，浓度0.2% 。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。3 实验方法将组织切成薄片，置入试管中；首先加入 EDTA 液 5ml ，室温下0.5h，离心弃之；再加入胰酶 -EDTA 液 5ml 。在 37恒温水浴振荡器内30min；用 300 目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm， 5min 。再以生理盐水洗2-3 次；细胞固定或低温保存备用。以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明， 用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低， 细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试剂可单独使用， 也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、 化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM 检测结果。（四）注意事项新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏死以及细胞自溶，影响FCM 测定结果；根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM 检测结果的不稳定；酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。需注意不同组织， 选择相应的方法； 如富于细胞的组织淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、 未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞； 在使用酶学方法时， 要重视酶的选用， 如含有大量结缔组织的肿瘤食管癌、乳腺癌、皮肤癌等， 选用胶原酶较好， 因为胶原酶具有在Ca+、Mg+ 存在或在血清状态下不发生活性降低的特性。二组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。1 取材后立即放入盛少许 PBS 液青霉素小瓶中；2另取一只小烧杯，杯口用 300 目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取PBS 液湿润；取新3 块以上；3 在操作前，先将剪刀用 PBS 液浸润一下，然后开始剪碎组织；4先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS 液，冲洗细胞均浆并过滤于小烧杯中； 如果这时仍有可见组织块， 再用剪刀剪碎， 再加适量该 PBS 液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞；5 细胞加固定液或低温保存，备用。三 石蜡包埋组织样本的制备石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析， 可以重新得到深入研究和利用。 现将常用的石蜡包埋组织制备单细胞方法介绍如下。1实验方法：把石蜡包埋组织切成 40-50um 厚的组织片3-5 片，或用乳钵研成0.5mm 直径大小颗粒状，放入 10ml 的试管中；加入二甲苯 5- 8ml, 在室温下脱蜡 1-2 天，视石蜡脱净与否，更换1-2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；水化：依次加入 100% 、 95%、 70%、 50%梯度乙醇 5ml，每步为10 min ，去乙醇，加入蒸馏水 3-5 ml ， 10 min 后弃之；消化：加入 2 ml 0.5% 胰蛋白酶（ pH 1.5-2.0 ）消化液，置37恒温水浴中消化 30 min ，在消化期间，每隔 10min 用振荡器振荡 1 次；消化 30 min 后，立即加生理盐水终止消化；经 300 目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第2 次消化；收集细胞悬液， 离心沉淀 1500 prm , 再以生理盐水漂洗 1-2次，离心沉淀 500-800 prm 去碎片；保存细胞备用。2 注意事项一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第1 遍应在 12 小时左右， 第 2 遍为 30min 左右，检测是否将石蜡已脱净的方法: 是弃去二甲苯，加入无水乙醇如果无絮状物浮起，即可视为蜡已脱净，反之则蜡尚未脱净；消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化；切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min ， 37，然后